摘要目的研究大鼠大脑中动脉缺血和再灌注模型中环氧合酶-2(COX-2)基因的表达。方法原位杂交方法。结果缺血30min再灌注组，血流再通4h后缺血区的大脑皮层有很强的表达并持续24h。缺血90min再灌注组和持续缺血组在缺血区以外的广泛大脑皮层显著表达，在海马的齿状回两侧及纹状体也发现表达。COX-2 mRNA的表达可被MK-801抑制。而NBQX和倍他米松对其表达没有影响。结论在缺血区、缺血周边部、缺血远隔区有NMDA受体介导的COX-2表达，阐明上述区域花生四烯酸代谢活性化。

Induction of cyclooxygenase-2 mRNA following transient and

permanent middle cerebral artery occlusion in rat

Luo Yinan,Huang Haiyan,Fang Xiaoxuan,et al.

Department of Neurosurgery,The First Teaching Hospital

of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021

AbstractObjectiveExpression profile of COX-2 mRNA following transient and permanent middle cerebral artery (MCA) occlusion in rat.MethodUsing in situ hybridization techniqne. ResultsCOX-2 mRNA was induced prominently in the ischemic cortex at 4h after 30min of transient occlusion and persistent induction was observed until 24h of reperfusion period. 90min of transient MCA occlusion and permanent occlusion induced COX-2 mRNA in the widespread region of the medial striatum,the bilateral hippocampal and the cerebral cortex,except the ischemic region. COX-2 mRNA induction at 4h of MCA occlusion was attenuated by administration of MK-801,but was not influenced by either NBQX or betamethasone.Conclusions These data suggest that COX-2 is induced in the surrounding and remote area of ischemic region as well as in the ischemic region by activation of NMDA receptor,consequently accelerae metabolism of arachidonic acid metabolism in these regions.

Key wordsCysclooxygenase-2Arachidonic acidFocal cerebral ischemiaIn situ hybridizationRat

脑缺血时细胞内的Ca²⁺增多，激活磷脂酶A和C，导致膜磷脂水解，释放出大量花生四烯酸^［1］，后者被环氧合酶(cyclooxygenase,COX)降解后释放出TXA₂和产生自由基，这些物质均可加速缺血后细胞损伤^［2］。有报告大脑中动脉(MCA)缺血模型大脑皮层也产生COX-2 mRNA表达^［3，4］。COX-2 mRNA表达和脑缺血时间相关性的研究尚无详细报告。本研究观察大鼠MCA缺血/再灌注及持续缺血时，COX-2 mRNA表达以及谷氨酰胺酸受体和倍他米松对COX-2 mRNA表达的影响。

1材料与方法

大鼠大脑中动脉闭塞模型:雄性SD大鼠，体重280g ～ 300g ， 由日本东北大学提供。 在0.5%～2%氟烷、NO₂和O₂混合气体麻醉下用头端圆形4-0尼龙手术线，由颈外动脉经颈内动脉插至大脑前动脉制成^［5］。手术中使直肠温度维持在37℃。

再灌注组：缺血30min或90min后血流再通4、8、24h。持续缺血组：缺血2、4、8、24h。药物治疗组：将MK-801(4mg/kg)和NBQX(90mg/kg)在手术30min前、倍他米松(4mg/kg)在手术3h前腹腔内给药，MCA缺血4h。空白对照组:实施手术而未栓塞。每组各5只。深麻醉下断头摘出脑组织并冷冻，制成厚约20μm的冠状面冰冻切片。

采用缺口平移法用［³⁵S］dATP标识寡核苷酸探针后，在42℃下进行孵育杂交18h，冲洗切片后，用Kodak XAR-5胶片，经3周放置进行放射自显影。

2.结果

2.1 COX-2mRNA的表达 COX-2mRNA在空白对照级广泛的大脑皮层的浅层及海马齿状、CA₁～CA₃区表达(见图1～3)。

MCA缺血30min，缺血区的COX-2mRNA减少，但再灌注组4h后的缺血领域的大脑皮层有很强的表达，持续8h、24h。其它部位未发现表达（见图1）。

缺血90min再灌注组在缺血区的大脑皮层没有COX-2mRNA表达，但在缺血区以外的广泛大脑皮层显著表达，在双侧海马的齿状回及纹状体也有COX-2mRNA表达（见图2）。

图1MCA 30min再灌注组COX-2 mRNA的表达

图2MCA 90min再灌注组COX-2 mRNA的表达

持续缺血组发现在缺血区以外的大脑皮层有显著的表达。在双侧海马的齿状回及CA₁～CA₃区有明显表达，纹状体区与缺血90min再灌注组相比有明显的表达(见图3)。

图3MCA持续缺血组COX-2 mRNA的表达

2.2谷氨酰胺酸受体激动剂及倍他米松对COX-2 mRNA表达的影响NBQX和倍他米松投药组对大脑皮层海马纹状体的COX-2 mRNA表达水平无有意义的影响，但发现MK-801投药组各区域的COX-2 mRNA的表达被明显抑制(见图4)。

图4投药组COX-2 mRNA的表达

3讨论

我们对缺血30min再灌注组、缺血90min再灌注组、持续缺血组及投药组4个不同缺血负荷的COX-2 mRNA的表达加以研究，在MCA缺血30min时，只表达纹状体外侧梗塞，而大脑皮质未发现梗塞。缺血30min再灌注组，在一度表达减少的缺血区的大脑皮层，从再灌注4h起，COX-2 mRNA的表达明显增加，这考虑局部没有形成梗塞，细胞修复机能尚没有发生不可逆损伤，同时随着血流再通，提供了修复所必须的氧和能量，此外COX-2 mRNA基因可在血流再通24h后持续的表达。

在缺血90min再灌注组及持续缺血组，缺血区的大脑皮层未发现COX-2 mRNA的表达，但缺血区周围大脑皮层及双侧海马的齿状回有显著的表达。这不同于30min再灌注组。随缺血时间的延长，缺血区的组织可发生不可逆损伤，细胞功能丧失。非缺血区由于受在缺血早期从缺血区释放出大量花生四烯酸的刺激，引起大脑皮层反复去极化，其结果使神经兴奋由大脑皮层扩散到双侧海马齿状回及CA₃～CA₁区^［6］。在海马CA₃～CA₁区COX-2 mRNA的表达仅表现在持续缺血组，说明此部位的表达需90min以上缺血刺激。30min再灌注组的非缺血区未发现COX-2 mRNA的表达，与90min再灌注组有差异性，可能是30min缺血时间不能形成对非缺血区阈上刺激所至。在纹状体COX-2 mRNA的表达仅表现在缺血90min再灌注组及持续缺血组。在缺血30min再灌注组未发现COX-2 mRNA的表达，这可能是在大鼠大脑中动脉闭塞模型中纹状体为不完全缺血区，这些部位的COX-2 mRNA表达对缺血时间有依赖性。

在本实验中，我们发现不论是持续缺血组还是再灌注组COX-2 mRNA的表达都持续24h，与Nogawa等^［4］的报告相符。COX-2 mRNA的持续表达机制是我们今后研究的关键。

在投药组，NBQX不能抑制COX-2 mRNA的表达，而MK-801对COX-2 mRNA的表达有明显抑制作用。Yamagata等^［7］在大鼠癫痫实验中发现大脑皮层的COX-2 mRNA的表达同样被MK-801所抑制，说明COX-2 mRNA的表达是由于NMDA受体的介入引起神经兴奋性增高所致。另一方面，由于倍他米松可阻止前列腺素A₂生成使花生四烯酸的代谢降低，Kujubu等^［8］报告倍他米松抑制末梢组织的COX-2 mRNA表达，还有在大鼠癫痫实验时对大脑皮质的COX-2 mRNA表达有抑制作用^［7］。但在本研究中，倍他米松对COX-2 mRNA的表达没有明显的影响，和文献相比有较大的差异，也许有必要给予更多的药物再进行观察。

由于COX-2 mRNA是花生四烯酸代谢所必需的酶，在COX-2 mRNA表达的上述部位，其代谢产物前列腺素和血栓素等产生增加，提示花生四烯酸代谢亢进。而这些代谢产物有脑血管收缩作用，可加重脑缺血后低灌注损伤，同时和自由基等可损伤血脑屏障引起血管通透性加大,加重缺血性细胞损害。而缺血区域以外COX-2 mRNA的表达可能与神经机能联系丧失有关，是我们今后研究的关键。

根据本研究，MCA闭塞后在缺血区、缺血周边部、缺血远隔区发现有NMDA受体介导的COX-2表达，在这些部位显示了花生四烯酸代谢的亢进，而缺血性细胞损害可能与自由基等代谢产物有相关性。

参考文献

1 Bazan NG. Effects of ischemia and electroconvul