摘要目的研究垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)对谷氨酸引起的海马神经元损伤的保护作用及其受体机制。方法海马神经元体外培养7d，给予谷氨酸。结果当谷氨酸是0.1～1.0mmol/L时，随着剂量的增加，神经元的存活率逐渐降低；10^-9mol/L～10^-13mol/L的PACAP，能减轻谷氨酸引起的海马神经元损伤；PACAP Ⅰ型受体特异性拮抗剂PACAP6-38能抑制PACAP减轻谷氨酸对海马神经元损伤作用。结论PACAP具有减轻谷氨酸引起的海马神经元损伤的作用，该作用是由PACAPⅠ型受体介导的。

The protective effect of PACAP on the damage

to hippocampal neurons induced by glutamate

Dong Yan,Ni Xin,He Cheng,et al.

Department of Neurobiology,Second Military

Medical University,Shanghai 200433

AbstractObjectiveTo investigated the protecive effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on the damage to cultured hippocampal neurons induced by glutamate and its receptor mechanism.Method Hippocampal neurons cultured in vitro for 7 days were treated with glutamate.ResultsThe survival of neurons decreased gradually as the concentrations of glutamate increased between 0.1 and 1.0mmol/L. PACAP between 10^-9 mol/L and 10^-13mol/L could protect hippocampal neurons from damage induced by glutamate. Specific PACAP Ⅰ type receptor antagonist PACAP6-38 could inhibit the protective effect of PACAP.Conclusions PACAP could protect hippocampal neurons from glutamate damage,which was mediated by PACAP Ⅰ type receptor.

Key wordsPituitary adenylate cyclase-activating

peptideGlutamateHippocampusNeuronReceptor

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)由38个氨基酸残基组成，是促胰液素/高血糖素/VIP家族的新成员。以往的研究表明，PACAP可作为一种神经递质或神经调质，在中枢和外周神经系统发挥作用。近来有研究提示，PACAP38 具有神经营养作用，可促进神经元存活，诱导神经元突起生长。此外，PACAP还能减少脑缺血引起的海马神经元死亡数量^［1］。但是，PACAP在神经系统损伤中保护作用的机制尚不清楚，本研究采用谷氨酸所致海马神经元损伤的模型，初步探讨PACAP的保护作用及其受体机制。

1材料与方法

1.1动物与试剂新生SD大鼠由上海计划生育研究所提供；PACAP38和PACAP6-38均为Peninsula公司的产品；DMEM购自Gibco公司；新生牛血清和胎牛血清由杭州四季青生物材料工程公司生产。

1.2神经元的培养取出生1d的SD大鼠，在无菌条件下分离海马，剔除血管和脑膜，剪碎，以0.125%胰酶37℃消化25min，用含20%小牛血清的DMEM终止消化，反复吹打制备细胞悬液。用含5%胎牛血清的B27培养基将细胞浓度调至0.3×10⁶/ml，并接种于涂有0.1mg/ml poly-L-lysine的96孔塑料培养板中，每孔100μl,于5%CO₂ 37℃培养箱中培养。24h后，换成B27无血清培养基，以后每周换液2次，每次换半液。

1.3实验分组培养7～9d的海马神经元随机分为(1)对照组：单纯加入B27培养基；(2)谷氨酸组：分别给予0.1、0.2、0.5和1mmol/L谷氨酸；(3)PACAP+谷氨酸组：在加入谷氨酸30min前分别给予不同浓度的PACAP(1×10^-7mol/L～1×10^-13mol/L);(4)PACAP组：单纯给予PACAP;(5)PACAP6-38+PACAP+谷氨酸组:在加入PACAP 30min前给予10^-9mol/L PACAP6-38，余处理同(3)组。

1.4细胞存活率的测定谷氨酸处理6h后，用MTT染色法测定细胞存活率^［2］。终止培养前4h加入10μl 5.0mg/ml MTT磷酸缓冲液(终浓度0.5mg/ml)，置于5%CO₂ 37℃培养箱中继续培养，4h后加入10% SDS-0.01mol/L HCl，溶解生成的深蓝色结晶，在酶标仪(Bio-Rad Model 550)上读取光密度(测定波长为570nm，参照波长为630nm)。

1.5数据处理细胞存活率=OD/对照组OD值均数×100%，实验数据均用±s表示，采用F检验处理，P＜0.05为差异显著。

2结果

2.1不同剂量谷氨酸对海马神经元存活率的影响当给予0.1、0.2、0.和1mmol/L谷氨酸6h后，神经元的存活率分别为84.98%±9.04%、74.77%±4.87%、69.77%±3.51%和69.38 % ± 3.11 % ， 与对照组( 100 % ± 5.04%)相比已显著降低(P＜0.01)，表明随着谷氨酸剂量的增加，神经元的存活率逐渐降低。选取1mmol/L谷氨酸作为本实验研究的条件。

2.2PACAP对海马神经元存活率的影响在加入1mmol/L谷氨酸前30min，给予4个剂量的PACAP，其中10^-9、10^-11及10^-13mol/L PACAP+谷氨酸组神经元的存活率分别为77.95%±5.54%、80.91%±3.44%和77.52%±5.14% , 与谷氨酸组(70.34% ± 3.93%)相比，相差非常显著(P＜0.01)；10^-7mol/L PACAP+谷氨酸组神经元的存活率为75.21%±2.92%，与谷氨酸组相比略有增加，但无统计学意义(P＞0.05)。为排除PACAP+谷氨酸组细胞存活率的增加是由于PACAP引起细胞数量增加所致的可能性，本实验同时观察了PACAP对正常海马细胞存活率的影响，结果表明，PACAP对正常海马细胞的存活率无影响。上述结果提示PACAP具有减轻谷氨酸引起海马神经元损伤的作用。

2.3受体拮抗剂对海马神经元存活率的影响给予PACAP Ⅰ型受体拮抗剂PACAP6-38后，神经元的存活率为74.30%±3.29% , 与PACAP+谷氨酸组(82.28% ± 4.36%)相比，显著降低(P＜0.01)，而单纯给予PACAP6-38，神经元的存活率为72.45%±4.15%,与谷氨酸组(71.32%±4.11%)相比，相差不显著，提示PACAPⅠ型受体拮抗剂PACAP6-38可抑制PACAP减轻谷氨酸引起海马神经元损伤的作用。

3讨论

脑缺血是一类严重危害人类健康的疾病，海马神经元对缺血损伤极为敏感。以往研究表明，许多物质能减少缺血引起海马神经元死亡的数量，但是因为不能通过血脑屏障而使其临床应用受到限制。近来研究提示，PACAP能减轻缺血性脑水肿，抑制小脑颗粒细胞的凋亡，保护神经元免受gp-120蛋白的损伤^{［1，3，4］}，并且能通过血脑屏障^［5］。因此，PACAP有可能成为一种新的脑缺血治疗药物。

脑缺血后，神经元会因细胞外兴奋性氨基酸，特别是谷氨酸的大量释放和堆积而受到损伤。本实验采用谷氨酸损伤模型，结果表明PACAP的浓度在比较低(10^-13mol/L)时，就能减轻谷氨酸引起的海马神经元损伤，当浓度为10^-11mol/L时，作用最为明显，而浓度为10^-7mol/L时，则不具有这个作用，形成一个“钟”形量效曲线，上述结果提示，PACAP具有减轻谷氨酸引起的海马神经元损伤的作用。

PACAP受体可分为两型：Ⅰ型受体对PACAP是特异性的；Ⅱ型受体与PACAP及VIP的亲和力相似，对二者无选择性。在中枢神经系统，以Ⅰ型受体为主，而Ⅱ型受体含量极低。本研究发现PACAPⅠ型受体特异性拮抗剂PACAP6-38能抑制PACAP减轻谷氨酸对海马神经元损伤的作用，提示PACAPⅠ型受体介导了PACAP减轻谷氨酸对海马神经元损伤作用。PACAPⅠ型受体与细胞内腺苷酸环化酶和磷脂酶C偶联，PACAP能增加细胞内cAMP和磷酸肌醇的含量，在体外cAMP类似物能促进海马、脊髓、视网膜及交感等多种神经元的存活^［6］。但是PACAP减轻谷氨酸对海马神经元损伤作用是否是通过细胞内cAMP依赖的蛋白激酶系统实现的，以及细胞内蛋白激酶C系统的作用是什么，都有待于进一步研究。

参考文献

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3 Arimura A,Somogyvari-Vigh A,Weill C,et al. PACAP functions as a neurotrophic factor. Ann NY Acad Sci,1994,739:228.

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