摘要目的以绿色荧光蛋白(GFP)作为一个标记，观察GFP标记的HTH₁基因修饰的NIH-3T3细胞在体外及植入脑内后的生长情况，判断GFP基因能否作为一种新的筛选标记基因。方法构建同时表达GFP和HTH₁双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH₁-SN。并转染NIH-3T3细胞，且移植入Parkinson病模型大鼠纹状体内。结果用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫组化、western blotting等方法均检测到GFP、HTH₁在体外和脑内的表达。结论GFP可作为一个筛选标记基因，可对目的基因或植入细胞的其他功能性产物的表达进行观察和检测。

Co-expression of both GFP and HTH₁ genes in the NIH-3T3

and in the brains of Parkinson^,s disease rats.

Zhu Junming,Tang Zhengsheng,Jiang Chenchuan,et al.

Department of Neurosurgery,Huashan Hospital,Department of Molecular Genetics,Shanghai Medical University,Shanghai 200040.

AbstractObjectiveTo observe co-expression of GFP gene and human tyrosine hydroxylase type 1(HTH₁)gene in vitro or in brains.Methods The multiple gene expression vector GC-GFP-P-HTH₁-SN which contained both GFP cDNA and HTH₁ cDNA was constructed and transfected into NIH-3T3 cells.NIH-3T3 cells which co-expressed GFP and HTH₁ were then implanted into the striatum of PD rats.The expression of GFP and HTH₁ in vitro or in brain was detected by fluoresent microscope,flow cytometry,immunohistochemical staining and western blotting etc.ResultsThe NIH-3T3 cells which transfectd with GFP and HTH₁ genes showed strong green fluorescent while positive with TH immunohistochemical staining.The HTH₁ protein was also detected by western blotting and the results showed there was protein band in 60 KD.The TH activity was detected by HPLC-ECD.After been implanted into the striatum of PD rats,a large number of green fluorescent cells and TH positive cells were found in the implanted sites.Conclusion GFP gene can be used as a marker gene in observing growth condition of donor cells which implanted into brain.

Key wordsGreen fluorescent proteinTyrosine hydroxylaseGene transferParkinson^,s disease

在组织细胞移植尤其是脑细胞悬液的移植研究时，常常不能将供体的神经细胞与宿主的脑组织细胞区别开来，因此不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况^［1］。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是新近发现的一种单体蛋白，很适合用来标记移植细胞，以观察移植细胞在宿主的动态变化。 特别是利用GFP与欲观察基因相连后转染细胞，易观察该蛋白在活细胞的动态变化^［2］。GFP具有的特点使之可作为活细胞探针，追踪细胞在体外及植入脑内后的生长情况，从而可以对脑组织移植的情况作一个较客观的评价。为证实这一点，本实验在运用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因修饰的细胞治疗帕金森病过程中，采用新近发展起来的多基因表达技术，选择新型标记基因GFP，将TH基因与GFP基因同时构建在一个用于多基因表达的逆转录病毒载体上，与TH基因在体外和脑内进行共同表达研究。

1材料和方法

1.1材料PA317细胞、NIH3T3细胞购自上海市肿瘤所。pKS(-)HTH₁质粒由日本藤田保健卫生大学Nagatsu教授惠赠，GCXPXSN载体、pGFPS65T质粒为第二军医大学东方肝胆外科研究所的钱其军博士所赠。抗TH单克隆抗体购于BM公司；G418、各种限制性核酸内切酶为BRL公司产品。

1.2方法质粒的转化、扩增、酶解、片段回收及连接按常规方法进行，采用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒。

1.2.1重组质粒GC-GFP-P-HTH₁-SN的构建首先用Not Ⅰ酶消化pGFPS65T质粒，回收约700bp的GFP cDNA片段，将此片段与NotⅠ单酶酶解的GCXPXSN载体进行连接反应，挑取克隆进行酶解鉴定。酶解鉴定为正向连接的质粒命名为GC-GFP-PXSN。用EcoRⅠ酶解pKS(-)HTH₁ 质粒，回收HTH₁ cDNA片段；用Sal Ⅰ酶酶解GC-GFP-PXSN，回收线性化的GC-GFP-PXSN，两者用Klenow酶补平粒端后，在T₄DNA连接酶作用下连接构成重组质粒。用限制性核酸内切酶酶解片段长度分析，筛选出正向连接的重组体，命名为GC-GFP-P-HTH₁-SN。

1.2.2转染PA317细胞DNA-磷酸钙共沉淀法转染PA317细胞。G418筛选形成克隆后，倾去培养瓶中的培养液，用PBS洗2次，再加入适量PBS，立即在荧光显微镜下观察。用蓝光激发，激发波长为495nm。挑选荧光最亮的克隆，命名为PA317-GFP-HTH₁细胞，继续扩增培养。

1.2.3感染NIH-3T3细胞感染前24h，胰蛋白酶消化PA317-GFP-HTH₁和NIH-3T3细胞，分别以1×10⁶细胞/(100mm/10ml)DMEM培养液(含10% 小牛血清)的密度接种培养。感染前倒去NIH-3T3细胞培养液，用PBS洗2次。吸取PA317-GFP-HTH₁培养液上清，0.45μm无菌过滤膜过滤，加入polybrene使其终浓度为8μg/ml,吸取2ml加入NIH-3T3细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱培养2h，倾去上清液，加入新鲜DMEM培养液，培养24h后，胰蛋白酶消化细胞，在含600μg/ml G418的DMEM培养液中培养，直至形成克隆。在荧光显微镜下挑选荧光最亮的克隆，命名为NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞，继续扩增培养。荧光显微镜观察、流式细胞仪检测、TH免疫组化、western blotting、酶活性测定等方法检测GFP和HTH₁在NIH-3T3细胞的表达。

1.2.4脑内移植NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞移植部位：Parkinson病模型大鼠纹状体，选取两个靶点，坐标分别为：(1)前囟前1mm，右旁开2.5mm，深度4.5mm;(2)前囟后1mm，右旁开3.5mm,深度5.5mm。每个靶点移植1×10⁶个细胞，2周后用4%多聚甲醛灌注动物，迅速取脑， 作相应层面的冰冻切片，立即在荧光显微镜下观察，并作TH免疫组化染色。

2结果

2.1GC-GFP-P-HTH₁-SN重组质粒的构建pKS(-)HTH₁用EcoRⅠ酶解后，产生2.7kb的pKS(-)和1.9kb的HTH₁cDNA片断，GC-GFP-PXSN用SalⅠ酶解后产生7.2kb的线性化质粒。分别回收1.9kb的HTH₁cDNA片断和线性化的GC-GFP-PXSN质粒， 用klenow酶补平粘端后行连接反应，连接产物转化JM109感受态，挑取克隆快速抽提质粒作限制性核酸内切酶酶解鉴定。重组体有正反两种连接形式，用BamHI、NotⅠ、xhoⅠ等内切酶酶解片段长度分析筛选出正向连接的重组质粒GC-GFP-P-HTH 1-SN , Bam HI酶解后产生 0.4kb、2.3kb和6.4kb三个片段，NotⅠ酶解后产生0.7kb和8.4kb两个片段，xhoⅠ酶解后产生1.5kb和7.6kb两个片段，证实为正向连接的GC-GFP-P-HTH₁-SN重组体。

2.2GFP、HTH₁在NIH-3T3细胞的表达收集PA317-GFP-HTH₁的病毒颗粒上清液，感染NIH-3T3细胞，24h后，约20%的细胞出现绿色荧光，经600μg/ml G418筛选，形成克隆，挑取荧光最亮的克隆，命名为NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞，扩增培养后的NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞，均发绿色荧光。收集扩增培养后的NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞，用流式细胞仪检测GFP的表达情况，结果也显示大部分NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞表达GFP。行TH免疫细胞化学染色，大部分NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞呈阳性反应。Western blotting方法检测NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞中HTH₁的表达，结果示在60KD处有一HTH₁条带。HPLC-ECD法检测NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞的TH酶活性，在有TH酶辅助因子BH₄存在的情况下，在其培养液中可以检测到L-DOPA，含量为85.4(9.1ng/10⁶细胞/24h)。

2.3GFP、HTH₁在脑内的表达将NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞立体定向植Parkinson病模型大鼠的纹状体内。2周后经组织切片观察，显示NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞在脑内存活并表达GFP和HTH₁。移植NIH-3T3-GFP-HTH₁细胞的部位出现大量发荧光细胞，而移植NIH-3T3细胞的对照组未出现荧光细胞，同一部位的相同层面有大量的TH阳性细胞和发绿色荧光的细胞。

3讨论

GFP来源于多管水母属的Aequorea Victoria，是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，分子量为2688Da。在不加外源底物的情况下，经蓝光或紫外光激发后会发出绿色荧光，可以直接在活细胞中进行检测^［1］。GFP在多种苛性条件下都很稳定，分子量小，大量表达对细胞没有毒性等特点，使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广泛前景，被喻为十分有用的活分子探针，在基因标记、基因表达控制、转基因的动植物研究、蛋白在细胞中功能的定位及蛋白间相互作用等方面有十分广泛的用途