摘要目的研究脑反复缺血再灌流羟自由基活性动态变化，探讨脑缺血损伤的病理生理机制。方法采用Pulsinelli和Brierley4 血管关闭方法，5min×3次缺血，用微透析针植入右侧海马CA₁区，用水杨酸盐捕获生成稳定的加合物2，3和2，5二氧苯甲酸(2，3和2，5 DHBA)。用高压液相(HPLC)电化学检测。结果腹腔内注射水杨酸盐和微管透析针内注射水杨酸盐，2，3和2，5 DHBA出现相似变化。缺血期2，3和2，5 DHBA稍降低，灌流20min显著增高，灌流1h升高至顶峰，持续3h。证明脑反复缺血后再灌流羟自由基显著增高，并且不是一个暂时的现象。结论自由基在脑缺血损害中起重要作用。

Dynamic study on free radical activity in rat

brain after ischemia and reperfusion

Jia Jianmin,Jia Jianping,Shen Yu,et al.

Department of Neurology,First Municipal Hospital of Handan,Handan 056002

AbstractObjectiveTo obtain direct evidence of oxygen radical activity,study on pathogenisis of cerebral ischemia.Methods We used chemical tripping of hydroxy1 radical in the form of the stable adducts 2,3- and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) following salicylate administration. Wistar rats were subjected to 5min×3 of global forebrain ischemia by 4VO,salicylate was administered either systemically (200mg/kg,i.p.)or by continous infusion(5mM) through a microdialysis probe implanted in the hippocompus. DHBA were assayed by HPLC with electrochemical detection. Results Following systemic administration of salicylate,stable baseline levels of HDBA were obeserved before ischemia a slightly reduction in mean levels of both DHBA was ducumented during ischemia. During recirculation,DHBA levels increased. It was peak for 1h. The increase in DHBA levels persisted for 3h. ConclusionThese results provide evidence that hydroxyl radical levels are increased during postichomic recirculation.

Key wordsCerebral ischemiaHydroxyl radicalMicrodialysisHippocampus

脑缺血后神经元损害有多种机理，兴奋性氨基酸神经毒性、单胺递质神经毒性、离子通道改变、钙超载、自由基反应等作用机制介导神经元死亡^［1］，其中自由基介导神经元死亡是一个最关键的作用^［2］。缺血和随之而来的再灌流为羟自由基生成提供了充足的条件。Siesjo提出自由基能够攻击膜脂质、各种酶类和DNA，并产生一系列有害的作用。Watanabe观察到应用各种自由基清除剂能有效保护脑细胞免受缺血死亡^［3］。Kinouchi应用基因转换鼠，观察到其局部脑缺血期间，能过度表达超氧化物歧化酶，进而减轻脑水肿，缩小梗塞范围。这些研究都提供了自由基损害的证据。

在本实验中，用水杨酸盐捕捉、脑内微管透析的方法测定缺血和再灌流期间羟自由基。 应用这个方法的原理是水杨酸盐和羟自由基生成稳定的加合物2，3和2，5二氧苯甲酸(2,3和2，5 DHBA)。

海马既是一个重要的记忆结构，又是一个对缺血损伤极为敏感的脑区。采用海马活体内微管透析，高压液相测定，动态观察缺血和再灌流期间自由基变化。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1动物雄性Sprague Dawley鼠，体重350±10g。由Otago大学医学院提供，分笼饲养。

1.1.2标准品2，3和2，5 DHBA、水杨酸盐均由Sigma公司提供。

1.1.3主要器材电烧针(Ohio，USA);立体定向仪(USA)；微透析针(Sweden);高压液相系统(USA)；体温调节器(Yellow springs,Ohio,USA)。

1.2实验方法

1.2.1全脑反复缺血再灌流动物模型制作方法按照Pulsinelli和Brierly方法并加以改良^［4］。烧灼双侧椎动脉，然后暴露双侧颈总动脉(CCA)，用血管夹关闭双侧CCA 5min，反复3次。在缺血期间，用体温调节器维持动物直肠温度在37℃。

1.2.2透析针植入大鼠用3%Halothan(混合70%氮氧化物和30%氧气)麻醉，气管插管，机械通气。根据Paxinos和Waston脑立体定位图谱，海马定位坐标是A：-5.8mm;V:8.0mm;L：4.8mm。切开头皮钻孔，直径4mm，微透析针外直径50μm,透析膜厚2mm，经颅骨孔缓慢向下插入，嵌入背侧海马CA₁。用微灌注泵(MA，USA)灌注Riger人工脑脊液。缺血前开始收集样品。

1.2.3生化分析用水杨酸盐俘获结合脑内微管透析法测羟自由基。(1)微管透析收集样品前，腹腔注射Salicylate 200mg/kg，高压液相分析2，3和2，5DHBA加合物含量。(2)透析液中不同的成分用C18-5μm微孔色谱柱(150×1mm)。柱内温度控制在35℃。流动相组成：0.027mmol EDTA,14.7mmol NaH₂PO₄，30mmol枸橼酸钠，10mmol diethylamine-HCL(pH3.1),476mg辛烷磺酸钠，CH₃CN(30ml)和四氢呋喃15ml。流速1ml/min。

1.3统计学处理

本文测定数值采用±s来表示，用t检验和方差分析进行显著性测定。

2结果

2.1腹腔注射水杨酸盐自由基测定结果2，3 DHBA基础值已测定。缺血期为20.86±0.50pmol/ml，较基线稍低，但无统计学意义(P＞0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,3 DHBA增高，分别为基础值的2倍、3倍、2.5倍、2倍、1.5倍，和缺血前相比有显著统计学意义(P＜0.01)，和假手术组及单纯对照组相比均显著增高(P＜0.01)。

2，5 DHBA基础值为60.12±0.65pmol/ml。缺血期为61.25±0.70pmol/ml，和基线相比,无统计学意义(P＞0.05)。再灌流10min为80.70±0.66,比缺血前增高(P＜0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,5 DHBA显著增高，分别为基础值的2.3倍、3.3倍、4倍、2倍、1.6倍，和缺血前相比有显著统计学意义，和假手术组及单纯对照组相比均显著增高(P＜0.01)。

2.2经过微透析针注入水杨酸盐自由基测定结果2，3 DHBA基础值为30.16±0.15pmol/ml，缺血期为32.66±0.20pmol/ml,较基线稍高,但无统计学意义(P＞0.05)。再灌流10min时为40.10±0.65pmol/ml，和基础值相比有显著统计学意义(P＜0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,3 DHBA分别为基线的2倍、3倍、2.7倍、2.3倍和2倍。和缺血前相比有显著的统计学意义(P＜0.01),和假手术组及单纯对照组相比均显著增加(P＜0.01)。

2，5 DHBA基础值为20.66±0.20pmol/ml，缺血前为22.36±0.20pmol/ml，较基础值稍增高，无统计学意义(P＞0.05)。再灌流10min时为25.36±0.20pmol/ml，和基线相比无显著统计学意义(P＞0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,5 DHBA增高，分别为基础值的1.8倍、3倍、2.5倍、2倍和1.5倍。和缺血前相比有显著的统计学意义(P＜0.01),和假手术组及单纯对照组相比均显著增加(P＜0.01)。

3讨论

自由基又称游离基，就是未配对电子的原子或原子团。羟自由基即羟氧自由基(hydroxyl radical,OH^.)，可以看作氧分子(O₂）三电子还原的产物。羟自由基在其氧原子上含有一个未配对的电子，故其夺取电子的能力很强,是一个很强的氧化剂，可以发生电子转移。OH^.可以从获得电子而变成OH^-，并使变为O₂。OH^.可以从多不饱和脂肪酸中夺取氢原子，形成多不饱和脂肪酸自由基，从而引发脂质过氧化反应、羟基化等。羟自由基寿命很短，不易用ESR检测，可以用化学捕捉方法。

Hall等用Gerbil鼠脑反复缺血再灌流，检测羟自由基增加，但他们仅仅测定2，5 DHBA含量的变化，由于2，5 DHBA也可反应细胞色素P-450的活性，而2，3 DHBA含量的变化对羟自由基有高度的特异性，故本实验用腹腔注射水杨酸盐和经过微透析针注入水杨酸盐，同时测定2，3和2，5 DHBA加合物的含量，使结果更为可靠，结果表明2，3和2，5 DHBA两种加合物出现相似的变化,且羟自由基的生成不是一个瞬间的现象，而是在缺血后要持续3h。这些结果和使用顺磁向旋捕捉方法相一致^［5］。

在脑缺血神经元损伤机制中，自由基和兴奋性氨基酸可能形成恶性循环链。脑缺血期间，海马细胞外液谷氨酸大量释放，再灌流期细胞外液谷氨酸可迅速恢复正常。自由基在缺血期生成减少，而在再灌流期占统治地位。这些结果提示在脑缺血损害时，兴奋性氨基酸和自由基相互作用。可能是谷氨酸大量释放，激活谷氨酸受体和发挥谷氨酸兴奋性神经毒作用，触发了再灌流期自由基的生成。