摘要目的探讨大鼠局灶脑缺血再灌注后神经节苷脂(GM₁)的保护作用及其对碱性纤维母细胞生长因子的特异性受体(FGFR₁)表达的影响。方法采用栓线法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。通过腹腔注射给予GM₁，利用免疫组化方法检测FGFR₁表达情况，并对病理学改变进行观察研究。结果与对照组相比，缺血再灌组FGFR₁表达明显增多(P＜0.01)，而GM₁用药组与缺血再灌组相比，FGFR₁表达也明显增多(P＜0.01)。光镜及电镜观察发现，单纯缺血再灌组梗塞区病理变化明显重于GM₁用药组。结论脑缺血后GM₁具有明确的保护作用，可减轻脑组织的损伤程度，并能使FGFR₁表达上调。GM₁可能通过影响FGFR₁表达水平而发挥其作用。

Protective function of GM₁ after cerebral ischemic

reperfusion and effect on the expression of FGFR₁

Zhao Chuansheng,Wang Muyi,Gao Xuguang,et al.

Department of Neurology,The First Affiliated Hospital

of China Medical University,Shenyang 110001

AbstractObjectiveTo study the protective function of GM₁ after cerebral ischemic reperfusion and effect on the expression of FGFR₁. MethodsWe made the local cerebral ischemic reperfusion model with thread embolism of middle cerebral artery. Immunostaining was used to study the expression of FGFR₁.ResultsThe expression of FGFR₁ in ischemic reperfusion group was significantly increased as compared with control group. Furthermore,FGFR₁ expression of GM₁ group was significantly increased as compared with ischemic reperfusion group. The pathological changes was also lighter than that of ischemic group.ConclusionGM₁ has significantly cerebral protective effect and can induce upregulation of FGFR₁ expression.

Key wordsGM₁Cerebral ischemic reperfusionFGFR₁

脑缺血后，梗塞灶边缘区的碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)及其特异性受体(FGFR₁)表达增加，bFGF-FGFR₁参与神经元的保护及修复过程^［1，2］。最近有研究表明神经节苷脂(GM₁)与bFGF有协同作用^［3，4］，但其机制尚不清楚。本文主要探讨脑缺血再灌注后GM₁的保护作用及对FGFR₁表达的影响，为其临床应用提供客观的实验基础资料。

1材料和方法

1.1实验动物与分组健康雄性Wistar大鼠40只，由中国医科大学实验动物中心提供，体重250～300g，随机分成4组。A组：正常对照组5只；B组：假手术组5只；C组：缺血再灌组15只；D组：GM₁用药组15只。其中C组缺血2h再灌注46h，D组于缺血和再灌注后5min内两次腹腔注射GM₁(用量为10mg/kg体重)。其它实验组于同一时间给予相同容量的生理盐水腹腔注射。GM₁由香港精优公司惠赠(批号021700)。

1.2动物模型的制备采用Longa改良的动脉栓线法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。缺血再灌组和用药组于手术后2h麻醉下将尼龙线拔出。假手术组除不插尼龙线外其余步骤同上。

1.3免疫组织化学标本制作动物缺血再灌注48h后迅速处死，在鼠脑距额极5～7mm处取2mm厚冠状切片，制成10μm厚脑切片，分别进行HE染色及免疫组化染色。

1.4电镜标本制作C、D组各取3只大鼠，迅速处死后，取鼠脑距额极5mm处的梗塞灶边缘区脑组织1mm³，经固定、脱水、包埋、切片、染色后，用JEM-200透射电镜观察、拍片。

1.5免疫组化染色采用SP法，鼠抗FGFR(VBS6，SC-276)为美国Santa-Cruz公司产品，SP试剂盒购自北京中山生物制品公司。

1.6图像分析与统计学处理应用Leuzex-F型图像分析仪，在400倍放大倍数下，每张切片随机选取5个区域，每个区域面积为200×200μm²,各组均抽取10张切片(即共50个区域),计数200×200μm²区域内免疫组化染色阳性细胞数。实验数据以均数±标准差(±s)表示，各组间应用t检验。

2结果

2.1病理学观察光镜下可见单纯缺血再灌组在右侧大脑皮质、基底节等区域神经细胞呈重度缺血性变化者较多。GM₁用药组在这些区域中神经元缺血变性者不仅数量减少，而且其受损程度也减轻。单纯缺血再灌组梗塞边缘区超微结构改变较重(见图1)，用药组的超微结构改变较轻，表现为细胞核不规则，染色质轻度聚集，核仁存在，线粒体大部分正常，少数轻度肿胀，嵴破坏，毛细血管内皮细胞轻度肿胀，星形胶质细胞足突轻度水肿(见图2)。

图1缺血再灌组神经细胞改变(×8000)

图2GM₁用药组神经细胞改变(×8000)

2.2免疫组织化学结果各组鼠脑切片均可见FGFR₁阳性细胞表达，呈棕黄色。正常对照组及假手术组鼠脑内可见FGFR₁阳性细胞散在表达，二者表达无明显差异，故合并作为非缺血对照组，该组阳性细胞数为(7.6±4.3)个/40000μm²。单纯缺血再灌注组、GM₁用药组与之相比皮质、基底节、海马等区域FGFR₁表达明显增加(P＜0.01),阳性细胞数分别为(16.2±5.4)个/40000μm²和(41.9±6.9)个/40000μm²，而GM₁用药组与单纯缺血再灌注组相比，FGFR₁表达亦明显增加(P＜0.01)。

3讨论

3.1GM₁的脑保护作用本实验通过病理学观察发现，缺血再灌组梗塞区病理变化重于GM₁用药组，这证实了局灶性脑缺血再灌注早期应用GM₁可明显减轻脑组织的不可逆性损害，从动物实验表明GM₁具有确切的脑保护作用。GM₁可能通过多种机制来对抗缺血后造成的脑组织损伤:(1)防止细胞内钙聚积，减轻脑水肿^［5］。(2)维持神经细胞膜和神经胶质细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶的活性，并减少神经细胞膜脂肪酸的丢失^［6］。(3)提高局部脑血流量，降低脂质过氧化反应^［7］。（4）GM₁抑制缺血引起的细胞外兴奋性氨基酸水平升高，并能选择性阻滞NMDA受体的病理性兴奋，但不影响该 受体对兴奋性氨基酸生理反应的信号传导^［8，9］。

3.2脑缺血后FGFR₁的表达及意义本实验通过免疫组织化学染色观察到缺血再灌组与对照组相比，FGFR₁表达明显增加，这与文献报道一致^［1，2］。脑缺血后，早期即可引起神经元和神经胶质细胞的bFGF合成增加，在细胞损伤或死亡后可将bFGF释放入细胞间隙，进而保护或修复那些表达FGFR₁的细胞,这意味着FGFR₁的表达与神经细胞存活密切相关。在脑缺血后，梗塞边缘区表达增加，这种变化是细胞对缺血损伤的一种协调反应，是神经细胞的一种自我保护机制,通过这种机制来减轻损伤程度并促进后期神经功能的恢复,但这种修复作用是部分的、不完全的。

3.3GM₁对FGFR₁表达的影响本实验发现GM₁用药组与缺血再灌组相比FGFR₁表达明显增多。如前文所述，脑缺血后内源性FGFR₁表达增加对保护神经细胞有重要意义，但这种表达水平有限，难以对受损神经元起全面持久的保护作用。在应用GM₁后FGFR₁表达上调，而且组织病理学改变相应减轻，这提示GM₁能加强脑缺血再灌注后的内源性修复过程。而且，这也可能是GM₁与bFGF发挥协同作用的一种机制。 在应用GM₁后FGFR₁表达增多，可促进更多的bFGF与细胞相结合，使bFGF更好地发挥作用，从而增强其效应。但这并不排除GM₁通过增强FGFR₁的活性与bFGF发挥协同作用的可能，这尚需进一步的深入研究。

参考文献

1 Mitsutoshi E,William A,John A.Transient global ischemia induces dynamic changes in the expression of bFGF and the FGF receptor.Molecular Brain Res,1994,22:76.

2 Masumura M,Murayama N,Inoue T,et al.Selective induction of fibroblast growth factor r