军医进修学院学报2000年第21卷第1期

王振福薛毅珑钟大光崔忻李新建马小军王鲁宁朱克

摘要：目的：观察微囊化牛肾上腺嗜铬细胞(BCC)脑内移植对偏侧帕金森病(PD)样猴的行为和脑组织液中单胺类物质含量的影响；评价微胶囊的免疫隔离效果。方法：以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)为材料包裹BCC。右侧颈内动脉注射甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)诱发PD样猴模型。将微囊化、非囊化BCC或空微囊分别植入PD样猴右侧尾状核和壳核，观察PD样猴行为、尾状核及壳核微透析液中单胺类物质的变化。结果：囊化组(n=6)和非囊化组(n=2)移植后1周开始PD样猴左侧上肢活动明显增加，阿朴吗啡(Apo)诱发的异常旋转次数减少。非囊化组猴在移植1～2个月后主动行为及Apo诱发的异常旋转圈数逐渐退回到移植前水平；而移植囊化BCC6只PD样猴的异常行为纠正效果，在观察的7个月内仍存在。空囊组(n=1)PD样猴异常行为无变化。移植前PD样猴右侧壳核、尾状核细胞外液中DA、DOPAC和HVA水平较左侧明显降低(P＜0.05)。移植后2、7个月时，囊化组右侧壳核、尾状核细胞外液中DA、DOPAC和HVA水平较移植前明显提高(P＜0.05)，但仍低于左侧的水平。结论：PD样猴脑内移植BCC后异常行为明显改善，微囊组的纠正效果明显优于非囊化组，其移植区DA及其代谢产生明显增加。APA微囊具有良好的免疫隔离作用，能明显延长BCC在异种脑内存活和发挥作用的时间。

关键词：帕金森病；异种移植；多巴胺；微胶囊；微透析

动物实验和临床研究已证实脑内移植多巴胺(DA)能细胞能够改善帕金森病(PD)的症状^［1，2］。我们以前对偏侧帕金森病(PD)样大鼠的行为及组织形态学的研究已表明，牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)脑内移植可部分纠正PD样大鼠的异常旋转行为，微囊化可明显提高BCC脑移植的效果，使其作用时间明显延长^［3］。但这种作用是否也可在进化上较高级的灵长类动物中实现，是否可使PD样动物脑纹状体区DA及其代谢产物的水平升高，还需验证。本实验以MPTP诱发的PD样猴为模型，观察微囊化BCC脑内移植对偏侧PD样猴的行为和脑组织液中单胺类物质含量的影响，进一步评价APA微囊的免疫隔离效果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物雌性恒河猴9只，年龄5岁，体重4.9～6.0kg。

1.1.2主要试剂和仪器甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)、阿朴吗啡(APO)、海藻酸钠和多聚赖氨酸(SIGMA公司)，SN-2型脑立体定位仪(日本)，静电液滴发生器(加拿大)，KH-1型微透析泵及透析针(中科院化学所)，HPLC分析仪(Waters公司)。

1.2方法

1.2.1偏侧PD样猴模型的制作经右侧颈内动脉注射MPTP(0.6mg/kg)诱发偏侧PD样猴模型^［4］。左侧肢体出现PD样症状，APO诱发出异常旋转行为6周以上猴为偏侧PD样猴。

1.2.2BCC的分离纯化及微囊包裹方法与我们以前报道相同^［3］。微囊直径200～300μm，每个微囊内含100～120个BCC。

1.2.3实验分组将PD样猴随机分为3组：①微囊组：6只，移植囊化BCC；②非囊组：2只，移植BCC；③空囊组：1只，移植不含BCC空微囊。

1.2.4移植手术硫贲妥钠(25g/L,15mg/kg)静脉麻醉动物，将其头固定于立体定位仪上。参照Snide猴脑立体定位图谱，分别向右侧尾状核头部、壳核3点移植约2×10⁶个BCC或2×10⁴个空微囊。

1.2.5行为观察于移植手术前、后观察PD样猴自发行为和诱发(Apo，0.2mg/kg)旋转行为的变化，移植后每2周诱发1次，2月后每4周诱发1次。对PD样猴移植前、后的行为录像观察。

1.2.6脑组织液微透析9只PD样猴移植前及微囊组6只PD样猴移植后2个月、7个月时，用脑立体定位、微透析方法采集尾状核头及壳核部位脑组织间液。人工脑脊液灌注速度2μl/min，每10min透析液作为1份样品，置入-80℃冰箱保存待测。

1.2.7脑组织液中单胺类物质的测定采用高效液相色谱电化学法^［5］测定脑组织透析液中去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、DA、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-HT和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的含量(pg/μl)。

1.2.8统计分析数据以±s表示，单胺类物质两样本间的比较用t检验。

2结果

2.1BCC脑内移植对PD样猴行为的影响PD样猴表现为左侧肢体以上肢为著的强直、少动、仅用右侧上肢抓取食物等症状；APO诱发猴出现快速异常旋转。移植2～3d后，微囊组及非囊组猴上述症状得到改善，左侧上肢出现搔痒、抓笼及抓食等活动，但仍以右侧上肢活动为多。移植1周后诱发的旋转次数明显减少。移植1～2个月后，非囊组猴得到改善的异常行为又逐渐退至移植前状态；微囊组猴异常行为得到纠正的效果在观察的7个月内仍存在。空囊组猴在移植后观察的7个月内其异常行为无改善(图1)。

图1PD样猴在脑内移植后Apo诱发旋转行为的变化

2.2BCC脑内移植对PD样猴新纹状体区组织间液中单胺类物质含量的影响

2.2.1移植前右侧尾状核、壳核细胞外液中DA、HVA和DOPAC水平较左侧明显降低，壳核分别减低73%(P＜0.05)、96%(P＜0.01)和82%(P＜0.01)；尾状核分别减低84%(P＜0.01)、93%(P＜0.01)和85%(P＜0.01)。NE、E、5-HT、5-HIAA两侧比较差异不显著(P＞0.05)。5-HT含量低未测出。

2.2.2移植后微囊组移植后2个月时，右侧壳核、尾状核组织间液中DA、DOPAC和HVA水平较移植前提高，壳核分别提高了2.1(P＜0.05)、1.3(P＜0.01)和4.1倍(P＜0.01)；尾状核分别提高了1.2(P＜0.05)、1.1(P＜0.05)和1.7倍(P＜0.01，图2)，但仍低于左侧的水平。移植后7个月时，右侧壳核组织间液中DA、DOPAC及HVA的水平较移植前，分别提高2.2(P＜0.05)、0.1(P＞0.05)和4.5倍(P＜0.01)；右侧尾状核较移植前分别提高1.0(P＞0.05)、1.6(P＜0.05)和1.8倍(P＜0.01)。

图2囊化BCC移植于PD样猴脑内2个月时右侧壳核(P)、尾状核(C)细胞外液中DA及其代谢产物含量的变化(±s，#P＜0.05，*P＜0.01)

3讨论

人类PD是由于黑质DA能神经元变性减少使得纹状体区DA含量明显降低而发病。本研究结果表明经猴一侧颈内动脉注射MPTP，能够可靠地造成同侧纹状体区细胞外液中DA及其代谢产物明显减少，诱发出对侧的帕金森病样症状。偏侧PD样猴能够自行进食饮水，容易长期存活及自身左右侧对照，可诱发出异常旋转行为，是研究PD的理想动物模型。

PD传统的治疗方法为口服左旋多巴(L-DOPA)类药物，L-DOPA通过血脑屏障进入脑内，在多巴脱羧酶作用下转化为DA，弥补纹状体区DA的不足而改善PD症状。近年来，人们通过脑内移植DA能细胞，企望以移植的DA能细胞代替变性的黑质神经细胞分泌DA，从而改善病人及动物的PD症状。临床研究移植物来源主要有胚胎黑质DA能细胞和自体肾上腺髓质嗜铬细胞两种。动物实验除以胚胎黑质DA能细胞作为移植物外，也常用异种肾上腺髓质嗜铬细胞、嗜铬瘤细胞株或基因修饰细胞作为移植物。临床研究及动物实验已证实DA能细胞脑移植能够改善由于黑质纹状体系统病变造成的PD症状和生化异常，但脑内移植仍面临着宿主对移植物的免疫排斥反应，影响移植物的存活及疗效发挥。

大脑曾被认为是免疫特免器官。近来研究表明其仅是部分免疫特免区，组织不相容性脑内移植仍会引起免疫排斥反应。我们以前的研究表明非囊化BCC脑移植仅可部分纠正PD样大鼠的异常旋转行为，并引起与免疫排斥反应有关的宿主脑组织炎性反应^［3］。微胶囊技术是近年出现的一种克服宿主对移植物免疫排斥反应的新方法。该方法是用具有生物相容性的高分子生物膜包裹组织细胞后，再移植于宿主体内。此膜是一种半通透性生物膜，允许小分子的营养物、分泌物及代谢物自由出入，限制大分子免疫球蛋白及细胞进入，从而保护移植物免受宿主免疫系统的攻击。在不同材料制作的微胶囊中，以SUN等^［6］首先发明的APA微囊最为理想，该微囊膜是由内外两层海藻酸中间一层聚赖氨酸构成的“三明治”样的结构，生物相容性好，体积小，机械强度高，可截割分子量大于110ku的物质。我们采用SUN等微囊技术制作的APA微胶囊，能够截割分子量70ku万以上的物质。免疫球蛋白分子量约为140ku，因此，APA微胶囊能够隔离移植物和宿主的体液及细胞免疫系统。

本实验以来源广泛的BCC为移植物，APA微胶囊包裹，异种移植于偏侧PD样猴右侧纹状体。结果表明：BCC