关键词： 肌浆网；Ca²⁺转运ATP酶；钙通道；心肌收缩

【摘要】目的探讨老年大鼠心肌肌浆网（SR）钙转运的改变及其在心脏收缩功能障碍中的作用。方法测定老年和成年Wistar大鼠心功能，取左心室肌组织制备肌浆网膜，采用Millipore滤过法测定心肌SR Ca²⁺摄取、Ca²⁺释放和 ³?H-Ryanodine受体结合，并测定心 肌SR Ca²⁺-ATP酶活性。结果与成年组比较，老年组大鼠左室舒张末压(LVEDP)升高82%（P＜0.05），左室内压变 化速率（±dp/dt）分别下降8%和24%（P＜0.05）；心肌SR Ca²⁺-ATP酶 活性〔 （6.26±1.22）与（12.34±1.46）μmol?Pi*mg^-1protein*h^-1, P ＜0.05〕与Ca²⁺摄取量〔（35.40±3.57）与(72.62±8.10)nmol Ca²⁺* mg^-1protein*min^-1,P＜0.05〕明显下降；老年心肌SR ³?H-Ryano dine受体结合最大值降低37%（P＜0.05），解离常数（Kd）值无明显变化，且心肌SR Ca²⁺释放速率明显降低〔（12.50±2.29）与（17.65±1.93）nmol Ca²⁺ *m g^-1protein*15s^-1,P＜0.05〕。结论老年大鼠心脏收缩功能下降，其机制涉及心肌SR Ca²⁺-ATP酶活性降低所致的Ca ²⁺摄取下降，及SR ³?H-Ryanodine受体结合量下降所致的Ca²⁺释放功能障碍。

Alterations in calcium transport of myocardial sarcoplasmic reticulum in aged rats

QI YongfenLIU XiuhuaWang Shiwen, et al.

（Research Institute of Cardio va scular Diseases, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034,China）

【Abstract】ObjectiveTo examine the status of sarcoplasmic reticulum (SR) with respect to Ca²⁺ transport and its role in myocardial contractile decline in aged rats. MethodsThe cardiac function was monitored in aged and adult rats, respe ctively. Vesicles of sarcoplasmic reticulum (SR) was prepared from left ventricl e. Myocardial SR calcium release, calcium uptake, and ³ H-Ryanodine receptor bind ing were determined using Millipore filtration technique. The activity of SR Ca ²⁺-ATPase was also determined. ResultsCompared with the adult rats, left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) in crea sed (P＜0.05) and the change rate of left ventricular endopressure (±dp/d t) decr eased (P＜0.05) in aged rats. The activities of SR Ca²⁺-ATPase 〔(6 .26±1.22） vs. （12 .34±1.46）μmol Pi*mg^-1 protein*h^-1 in adult rats, P ＜0.05〕 and the calcium uptake 〔(35.40±3.57） vs. （72.62±8.10） nmol C a²⁺*mg^-1 protein*min -1 in adult rats, P＜0.05〕 in th e myocardium of the aged rats were reduced significantly. The Bmax of SR ³?H -Ryan odine in the myocardium of the aged rats decreased to 37%（P＜0.05）， but there w as no significant changes in Kd values between aged and adult groups. Calcium re lease was also decreased〔（12.50±2.29） vs. （17.65±1.93） nmol Ca ²⁺*mg^-1 protein*15 s^-1, P＜0.05〕in aged myocardiu m. ConclusionsThe reduced cardiac contractile in ag ed rats might be associate with the decrease of calcium uptake resulted from the reduction of SR Ca²⁺-ATPase activity, and also with the dysfunction of ca lcium release induced by the decrease of SR ³ H-Ryanodine binding.

【Key words】Sarcoplasmic reticulum; Ca²⁺-transporting ATPase; Calcium channels; My ocardial contraction

老年期心脏收缩、舒张功能进行性下降，心脏贮备功能降低,是心功能不全的重要发病学基础。其机制尚未完全阐明,心肌细胞内Ca²⁺的变化是细胞兴奋-收缩偶联和心肌收缩-舒张功能的主要决定因子；心肌肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）是调控心肌细胞内钙稳态的重要细胞器，它通过快速摄取和释放Ca²⁺，对心肌舒缩活动产生重要影响。我们于1999年3～5月通过比较老年和成年大鼠心肌组织SR的Ca²⁺摄取与释放功能，探讨老年期心脏舒缩功能改变的细胞分子学机制。

材料与方法

一、方法

1.血流动力学监测

健康雄性老年（24月龄）和成年（4月龄）Wistar大鼠(北京大学医学部实验动物中心提供)各12只，术前禁食过夜，自由饮水，以乌拉坦〔1 g/kg，腹腔注射(i.p)〕麻醉，肝素（1000 U/只,i.p）抗凝血。左颈总动脉插管（PE90）到左心室，经换能器联接四道生理记录仪记录心室内压，左股动脉插管监测动脉血压。手术后稳定30 min分别记录基础心室内压和动脉血压，并于实验过程中动态观察其变化，实验结束时快速放血处死大鼠，摘取心脏称取左心室（包括室间隔）重量后进行下述操作。

2.心肌SR制备与细胞器标志酶测定

按Osada等^〔1〕的方法制备心肌SR膜：取定量左心室组织置于4℃匀浆液（NaHCO₃ 10 mmol/L,NaN₃ 5 mmol/L,Tris-HCl 15 mmol/L,pH 6.8）进行匀浆，经离心（9 500 r /min,20 min）去除细胞碎片，上清液再离心（19 000 r/min,45 min），将沉淀悬浮于缓冲液（KCl 600 mmol/L,Tris-HCl 10 mmol/L,pH 6.8）中离心（19 000 r/min,45 min），沉淀即为SR膜，悬浮于缓冲液〔sucrose 250 mmol/L,histidine 10 mmol/L(购自美国Sigma 公司)〕中，以Lowry等^〔2〕方法测定蛋白含量，并参照文献〔1〕分别测定SR膜制 备中SR标志酶葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase)，质膜Na⁺-K⁺-ATP酶(Na⁺-K⁺-ATPase)和线粒 体细胞色素C氧化酶（cytochrom C oxidase）活性，以鉴定SR膜的纯度。

3.心肌SR钙摄取与释放的测定

心肌SR钙摄取活性测定采用Millipore滤过法^〔1〕，制备的SR膜0.03～0.07 mg和摄取反应液〔Tris-ATP 5 mmol/L,NaN₃ 5 mmol/L(购自美国Sigma公司),KCl 100 mmol/L,MgCl 25 mmol/L,potassium oxalate 5 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L,Tris-HCl 20 mmol/L,pH 6.8〕1 ml,37℃预孵育3 min，参照游离Ca²⁺浓度计算软盘提供的数据加入⁴⁵ CaCl₂(购自NEN DuPout公司)启动摄取反应，控制反应液中Ca²⁺浓度为10^-7～10^-5mol/L。反应结束时取200 μl上述反应混合物在Millipore上以0.45 μm的滤膜进行抽滤，以加与不加ATP反应的滤膜⁴⁵Ca²⁺放射活性之差代表ATP依赖的SR ⁴⁵Ca²⁺摄取量，以nmol Ca^2+.mg -1protein·min^-1表示。

按Ganguly等^〔3〕的方法测定SR Ca²⁺释放速率:以制备的62.5 μg SR膜悬浮于释放反应液(KCl 100 mmol/L,MgCl₂ 5 mmol/L,potassium oxalate 5 mmol/L,NaN 35 mmol/L,Tr is-HCl 20 mmol/L，pH 6.8)625 μl中,在室温下加入10 μmol/L ⁴⁵CaCl₂ (20 mCi/L, 1 mCi=37 MBq),5 mmol/LATP共孵育45 min，加入1 μmol/LEGTA反应15 s，测定EGTA诱导的Ca²⁺释放速率，以Millipore抽滤结束反应，以nmol Ca^2+.mg^-1protein·15 s^-1表示。

4.心肌SR与³H-Ryanodine受体结合分析

按改良的Inui等^〔4〕的方法进行：以40 μg SR膜悬浮于反应液〔KCl 120 mmol/L,HEPES 20 mmol/L(购自美国Sigma公司),EGTA 0.5 mmol/L,NaCl 300 mmol/L,pH 7.2〕中, 加入³H-Ryanodine(购自NEN DuPout公司)1～40 nmol/L，反应终体积为200 μl，于37℃孵育 30 min。非特异管中加入10 μmol/L的未标记的Ryanodine。结束实验时将反应液迅速通过0.45 μm的微孔滤膜，冲洗3次，滤膜干燥后加入闪烁液，在β液闪计数仪上测定〔³H〕的放射活性，总结合量与非特异性结合量之差即为³H-Ryanodine受体结合量。

5.心肌SR Ca²⁺-ATP酶活性测定

按Jones等^〔5〕的方法，将10 μg SR膜悬浮于反应液(组氨酸50 mmol/L，KCl 111 mmol/L,EGTA 1 mmol/L,pH 7.4）1 ml中，参照游离Ca²⁺浓度计算软盘提供的数据加入50 mmol /L的CaCl₂(对照管不加CaCl₂)，置37℃水浴振荡10 min，加入3 mmol/L的Tris-ATP启动反应，在37℃反应20 min；以比色定磷法测定无机磷含量，以含Ca²⁺与不含Ca ²⁺管之差计算SR的Ca²⁺-ATP酶活性。

二、统计学处理

实验结果以均数±标<