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【摘要】目的研究高浓度多巴胺（DA）对神经细胞的毒性作用。方法观察不同浓度、不同时间DA对体外培养神经细胞的毒性，并用琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记、流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果(1)高浓度DA引起神经细胞凋亡；(2)给予80、160、320 μmol/L DA处理24 h后神经细胞凋 亡 率分别为(41.49±1.32)%、(65.67±1.68)%、(84.65±2.21)%，明显高于浓度效应对 照组〔(2.07±0.26)%，P＜0.05〕；(3)在给予300 μmol/L DA处理的条件下，经 过12、24 、48 h后，神经细胞的凋亡率分别为(37.90±0.39)%、(69.34±3.31)%、(82.07±0. 86)%，明显高于时间效应对照组〔(2.30±0.11)%，P＜0.05〕。结论高浓度DA对体外培养神经细胞具有细胞毒性，诱导神经细胞凋亡，具有时间及剂量效应。
The effects of dopamine on culturing neurons
QU WenjunXU RuxiangCAI Yingqian, et al.
（Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, Frist Military Medical University, Guangzhou 510282,China）
【Abstract】ObjectiveTo study the toxicity of dopamine in high concentration to neurons.MethodsThe toxicity of dopamine to neurons was observed in different concentrations for different time-periods in vitro. Neuron apoptosis was analyzed by gel electrop horesis, in situ DNA end-labeling and flow cytometry. Results (1) the high concentration of dopamine induced apoptosis of the culturing neuro ns; (2) at 24 h after treating with 80, 160 and 320 μmol/L dopamine, neurons ap op totic rates were (41.49±1.32)%, (65.67±1.68)% and (84.65±2.21)%, respe ctively, being significantly higher than that of the control group 〔(2.07±0. 26)%, P＜0.05〕; (3) at 12 h, 24 h and 48 h following 300 μmol/L dopamine adm inistration in the culturing medium, the apoptotic rates were (37.90±0.39)%, (69.34±3.31)% and (82.06±0.86)%, respectively, and also significantly high er than that of the control group 〔(2.30±0.11)%, P＜0.05〕. ConclusionsOverdose of dopamine showed a significant cytotoxic effect on culturing neurons and induced the neuron apoptosis in both dose and time dependent manners.
【Key words】Dopamine；Neuron;Cells cultured； Apoptosis
帕金森病是最常见的中枢神经系统疾病之一，也是老年人神经源性致残的主要疾病之一，其 病因尚未完全明确。目前主要应用多巴胺（DA）前体左旋多巴进行治疗，但长期使用后，左旋多巴疗效降低，而副作用增多。为了探讨其副作用机制，我们于1997年8月至1999年3月通过观察DA对体外培养大鼠皮质神经细胞的直接作用，就高浓度DA对神经细胞的毒性进行了初步评价。
材料与方法
一、神经细胞的培养
参照Skaper等〔1〕建立、并经Ebstein等〔2〕改进的方法。将SD大鼠（孕15 ～20 d）脱颈椎处死，75%酒精浸泡10 s，无菌条件下取出胎鼠于解剖显微镜下去除脑膜、血管等结缔组织，取出脑皮质，剪碎。用D-Hanks液洗涤3次，加入0.125%胰蛋白酶于37℃下消化10～15 min，再用DMEM培养基〔含10%胎牛血清(FCS)〕中止消化，800 r/min离心10 min，弃上清，以DMEM培养基（含10%FCS，25 mmol/L KCl，青霉素100 μg/ml，链霉素100 μg/ml）制成细胞悬液。台盼兰染色、计数后接种于多聚赖氨酸涂布表层的24孔培养板或35 mm培养皿中，接 种密度8 000～10 000个/ml，置于5%二氧化碳孵箱内培养，3 h后更换培养基，18～24 h后 加入阿糖胞苷10 μmol/L以抑制胶质细胞等杂细胞的分裂生长，6～7 d后换液，再加入不含 FCS的培养基。1周后细胞成熟，用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学鉴定。Skape r等〔1〕报道，用此方法培养神经细胞其纯度可达到95%以上，我们通过预实验证实 神经细胞的纯度在90%以上。
二、分组
参考Skaper等〔1〕及Michel和Hefti〔3〕的研究并结合预实验结果发现，体外培养单纯的神经细胞在6～7 d胞体饱满且轴突较清晰，在10～12 d后开始发生自然死亡。 因此选定在细胞培养1周时开始实验。
1. 浓度效应组：参照Masserano等〔4〕对培养的儿茶酚胺能细胞作用所采用的DA浓度梯度，并结合预实验结果，对相同条件下培养1周的神经细胞分别加20、80、160、320 μ mol/L不同浓度的DA，于24 h后观察细胞的凋亡情况，重复5次。
2. 时间效应组：培养1周后的神经细胞加入300 μmol/L浓度的DA，观察3、12、24和48 h的细胞凋亡情况，每时点组重复5次。
3.对照组：分别设浓度效应对照组和时间效应对照组。浓度效应对照组不经多巴胺处理，其 他条件相同。各对照组同样重复5次。时间效应对照组加入300 μmol/L DA，但处理时间为0 h。
三、观察指标
1.琼脂糖凝胶电泳法分析DNA片断：参照Masserano等〔4〕的方法，收集经DA处理后的原代培养神经细胞，细胞数约5×106，PBS漂洗，应用饱和酚抽提法提取DNA样品，用双蒸水重悬 样品，DNA样品加入1.5%琼脂糖中电泳，琼脂糖中含0.5 mg/L溴化乙锭(EB)。
2.原位末端标记法(Tunel法)检测DNA片断的3'-OH端：按美国Oncor公司产Apop Tog kit说 明书介绍的Tunel法，地高辛标记的脱氧核苷酸在末端脱氧核糖核酸转移酶作用下与凋亡细胞DNA 3'-OH末端结合，通过二氨基联苯胺搭桥显色，检测神经细胞凋亡情况。
3.流式细胞仪定性、定量分析细胞凋亡：培养的原代细胞（含95%的神经细胞）制成单细胞悬液，依Nicoletti等〔5〕的方法，将单细胞悬液1 000 r/min离心10 min，200目筛 网过滤，用已预冷的70%乙醇在4℃下固定60 min，0.1 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液冲洗3次，离心，用0. 5 ml PBS液重悬，加入核糖核酸酶（1 mg/ml,PBS溶解)0.5 ml，37℃水浴30 min，加入碘 化丙啶（PI，100 μg/ml,PBS溶解）。4℃避光保存15 min，上机检测。
三、数据分析
应用SPSS 7.5软件进行统计分析，显著性检验采用单因素方差分析。
结果
一、培养神经细胞的NSE免疫组化鉴定结果
培养1周后的神经细胞胞体饱满，轴突明显，NSE染色绝大部分细胞胞体及轴突呈棕黄色阳性染色，证实是神经细胞。见图1、2。
图1正常体外培养的神经细胞相差照像×132
图2NSE染色鉴定的正常神经细胞SP法×132
二、DA引起神经细胞凋亡
1.在琼脂糖凝胶电泳中，DA处理组出现180～250 bp的梯形DNA带，见图3。
1 正常神经细胞DNA带；2、3、4分别是经80、160、320 μmol/L DA处理后的DNA带，可见梯形带
图3琼脂糖电泳图
2.Tunel法检测暴露于不同浓度DA中、不同时间的神经细胞凋亡情况：正常细胞着色为绿色，见图4。凋亡细胞呈棕黑或棕黄色阳性染色，部分可见凋亡小体，胞体仍完整，见图5～7。
图4原位末端标记法检测正常神经细胞，甲基绿 复染后呈绿色Tunel法×400
5～780、160、 320 μmol/L DA处理后的神经细胞可见凋亡的阳性染色和棕褐色凋亡小体（↑） TUNEL法× 400
3.流式细胞仪定性分析：经DA处理后的神经细胞在G1期前出现明显的亚2倍体峰，而未经DA处理的细胞，几乎无亚2倍体峰，见图8、9。流式细胞仪定量分析结果见表1、2。随DA浓度及作用时间增加，神经细胞凋亡率增高，从80 μmol/L及12 h起，与对照组差异有显著性。
