关键词： 松果体；褪黑激素；淀粉样β蛋白；神经变性

【摘要】目的探讨松果体功能减退致褪黑素（MT）分泌减少对β-淀粉样蛋白（Aβ）神经毒性的影响及其初步机制。方法将SD 6周大鼠随机分为2组，实验组摘除松果体，对照组给假手术，2组均在术后40 d给予Aβ_1-40 10 μg右侧海马注射,7 d后标本用Nissl、HE、改进甲醇刚果红染色，TUNEL原位标记方法检测海马神经元病理变化。结果以图像分析仪测量Nissl染色神经细胞带丢失情况，发现实验组丢失长度〔（694.63±81.09）μm〕明显多于对照组〔（406.57±92.38）μm,P＜0.01〕；细胞凋亡数在HE染色（16.37±5.30）个和TUNEL法（38.92±8.81）个均比对照组相应显色方法增多〔分别为(7.29±2.50)个、(20.63±5.28)个，均为P＜0.01〕；Aβ_1-40注射周围的胶质细胞浸润数（276.37±36.33）个也明显多于对照组〔（187.93±21.81）个，P＜0.01〕。结论大鼠松果体摘除可以加重Aβ神经毒性作用，其机制可能是加重了炎症反应。

Effects of pinealectomy on the neurotoxicity of amyloid β protein

XU Bin, CHEN Junpao, LIN Yu , et al.

（Department of Neurology, Zhujiang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510282 ,China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of decreased secretion of melatonin caused by pinealectomy on the neurotoxicity of amyloid β protein (Aβ) and primarily the mechanism. MethodsThe 6 week old SD rats were randomly divided into two groups. Experimental rats were pinealectomized and the control group was performed by sham operation. Amyloid β protein 1-40 (Aβ_1-40) 10 μg in 1μl was injected into the rat hippocampus at the 40th day after operation. The pathological changes of the hippocampus neurons were examined with toluidine blue, haematoxylin-eosin, improved Congo-red staining and terminal deoxynucleotidyl-transferase mediated d-UTP-biotin nick end labeling (TUNEL) at the 7th day after injection. ResultsIt was showed from the Image Analyser that the Nissl-stained depletion in the hippocampus neuron band of the experimental group was significantly wider than that of the control group〔(694.63±81.09) vs (406.57±92.38)μm, P＜0.01〕. The number of apoptotic cells by HE staining and TUNEL method in the pinealectomized rats were increased significantly than that in the control group 〔(16.37±5.30) vs (7.29±2.50)cells/field; (38.92±8.81) vs (20.63±5.28) cells/field, P＜0.01〕 respectively. The number of infiltrated glial cells around the injection site in the experimental group were also significantly increased than that of the control group〔(276.37±36.33) vs (187.93±21.81)cells/field, P＜0.01〕 .ConclusionsInflammatory infiltration of glial cells might contribute the mechanism of amyloid β protein neurotoxicity due to pinealectomy.

【Key words】Pineal body;Melatonin；Amyloid beta-protein; Nervo degeneration

目前，关于阿尔茨海默病(AD)的病因和发病机制仍不清，但多数学者认为家族遗传及各种环境因素的交织构成AD发病的复杂病因谱，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积可能是所有因素导致AD发病的共同途径。1995年Maurizi^〔1〕提出褪黑素（MT）减少是引起AD的病因，其理由为：(1)AD患者中MT明显减少；(2)MT可以显著清除羟自由基；(3)AD患者脑细胞中线粒体DNA损伤与羟自由基损害作用一致。Pappolla等^〔2〕通过神经母细胞瘤细胞（N2a）、嗜铬细胞瘤细胞（P12）培养，发现MT可以抑制Aβ诱导细胞凋亡。我们也发现MT于在体水平可以抑制Aβ诱导海马细胞凋亡及其神经毒性作用^〔3〕。但目前尚无MT减少与Aβ神经毒性关系的报道，我们于1999年1～9月通过摘除大鼠松果体制成MT缺失模型，然后给海马微量注射Aβ_1-40，观察Aβ神经毒性变化情况，初步探讨MT减少和Aβ神经毒性的关系。

材料与方法

一、药品及试剂

Aβ_1-40购自美国Sigma公司，注射前用无菌生理盐水将Aβ_1-40稀释成10 μg/μl，37℃下孵育1周备用。TUNEL原位标记试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。

二、实验动物及MT缺失模型的制备

雄性SD大鼠16只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重190～210 g，鼠龄6周，随机分为2组，实验组和对照组各8只，置隔音环境中，室温18～22℃，11 h光照（8∶30～19∶30），13 h黑暗（19∶30～8∶30），自由摄食、饮水，适应3 d后行手术。实验组行松果体摘除术，参考文献〔4〕方法进行，对照组行假手术，手术均在19∶30～22∶30进行，每次手术做实验组和对照组大鼠各1只，术后单独饲养，7 d后实验组和对照组大鼠分别放一起。继续饲养33 d后，实验组和对照组均给予Aβ_1-40右侧海马注射。首先用10%水合氯醛腹腔注射（0.4 ml/100 g体重）麻醉大鼠，头部固定在立体定向仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》^〔5〕，选右侧海马为注射区，定位坐标：前囟后3.0 mm，右侧旁开2.2 mm，硬膜下2.9 mm。在坐标点周围用牙科钻环行钻开颅骨并分离暴露硬脑膜，缓慢垂直进针，注射Aβ_1-40溶液1 μl（10 μg），注射时间5 min，留针5 min，然后缓慢撤针。

三、组织切片制备

Aβ_1-40注射后7 d，将大鼠再次麻醉（10%水合氯醛0.6 ml/100 g体重腹腔注射），暴露心脏，通过左心室插管至主动脉，生理盐水100～150 ml冲洗，10%中性缓冲甲醛溶液150 ml快速灌注，250 ml慢滴，2 h后取脑，检查实验组松果体摘除是否完全，淘汰松果体去除不完全者，对松果体摘除完全者以及对照组取标本（标本选在注射部前后1.5 mm处，标本厚3 mm），后固定3 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度6 μm，脑组织出现损伤时取片，每隔30张（间隔距离180 μm）取4张平片，直到损伤消失。一套用做甲苯胺蓝Nissl染色,一套HE染色,另抽数张切片做改进甲醇刚果红染色，最后一套用于TUNEL原位标记法。

四、组化及TUNEL法标记DNA片段

Nissl染色用于观察海马神经元丢失情况，HE染色用于观察注射周围胶质细胞反应及神经元凋亡。改进甲醇刚果红染色用于观察Aβ沉积及Aβ周围胶质细胞浸润情况，对周围神经元损伤也可显示。其操作如下：(1)石蜡切片，常规二甲苯、乙醇下行脱蜡至水；(2)Harris苏木素染色5 min,自来水冲洗数分钟；(3)1%盐酸酒精分化数秒，温水显蓝；(4)甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗数分钟；(5)0.2%碱性酒精液分化数秒，自来水冲洗；(6)常规脱水、透明、封片。TUNEL原位标记DNA片段检测凋亡细胞，操作步骤按试剂盒说明书进行。

五、海马神经元病理改变的观察

神经元变性体积计算参照Morimoto等^〔6〕的方法。在Leica Diaplan显微镜及Leica Quantimet 500⁺图像分析仪上，测量Nissl染色组织切片海马CA_1～4以及齿状回神经元细胞带变性、坏死、细胞丢失的程度。由于海马细胞带的宽度是一定的，海马神经元变性、坏死、细胞丢失的体积V=∫∑ay_idx，y_i（μm）：海马CA_1～4以及齿状回神经细胞带病理改变的长度；a（μm）：海马细胞带的宽度；dx（μm）：组织切片间隔距离，即180μm。由于a、dx是恒定的，V只与y_i有关，所以我们仅以神经元损害的长度作指标来反映海马神经元损害程度。炎症改变情况以40倍物镜下HE染色组织切片上Aβ_1-40沉积部周围浸润胶质细胞数（每张切片选择3个相近视野，取平均值）反映炎症变化情况。凋亡细胞计数可在HE染色或在TUNEL原位标记法上进行，方法同胶质细胞计数，部位选在海马神经元病理改变明显处。

六、统计方法

组间均数比较用SPSS8.0forwindows进行非配对t检验。

结果

一、海马神经元变性、坏死、丢失情况

正常海马细胞由神经细胞和胶质细胞组成，主要的神经细胞规则地排列，使海马结构非常清楚，如CA_1～3锥体细胞和齿状回颗粒细胞。假手术组Aβ_1-40注射7 d后，海马神经元病理改变仅限于CA₁注射针道和齿状回Aβ_1-40沉积局部的神经元，表现为锥体细胞带和颗粒细胞带紊乱、变稀、中断，高倍镜下见到神经元胞膜破裂、细胞萎缩、胞核变小（图1），但距齿状回较远处很少有或仅有很轻病理改变。松果体摘除组Aβ_1-40注射，不仅CA₁注射针道和Aβ_1-40沉积局部有较明显形态学改变，而且距Aβ_1-40沉积较远处神经元也有病理改变，表现为CA₁注射针道明显增宽，锥体细胞带和颗粒细胞带病变更明显，可见很长齿状回颗粒细胞带消失（图2）<