关键词： 成纤维细胞/细胞学；衰老；凋亡

【摘要】目的研究体外培养的人成纤维细胞衰老时可诱发凋亡的能力。方法用丁酸钠和去血清两种方法诱导人衰老和年轻成纤维细胞，以细胞生存曲线、细胞形态和超微结构、DNA断裂电泳图谱、流式细胞仪分析凋亡峰等手段检测凋亡的发生情况。结果50 mmol/L的丁酸钠诱导年轻细胞48 h即发生凋亡，而衰老细胞需96 h；去血清诱导年轻细胞15 d左右发生凋亡，而衰老细胞此时尚未出现凋亡现象。结论人衰老成纤维细胞可诱发凋亡的能力明显低于年轻细胞。

The ability of inducing apoptosis in human senescent fibroblasts

HUANG Ying

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)

ZHANG Zongyu

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)

TONG Tanjun.

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the ability of inducing apoptosis in senescent human fibroblasts cultured in vitro.Methods Senescent and young human fibroblasts were induced by sodium butyrate (NaBu) or serum-deprivation. Apoptosis was observed from analysis of cell survival curve, cell morphological and ultrastructural changes, DNA fragmentation electrophotogram and flow cytometry. Results50 mmol/L NaBu induced apoptosis in young cells after 48 hours; while in senescent cells it happened after 96 hours. Serum-deprivation induced apoptosis in young cells after about 15 days; while in senescent cell, no apoptotic phenomena showed at this time.Conclusions The ability of inducing apoptosis in senescent human fibroblasts is apparently lower than that in young ones.

【Key words】Fibroblasts;Aging;Apoptosis

凋亡（apoptosis）是不同于坏死的细胞自主性死亡，在正常组织的发育更新、成体组织的稳态维持和疾病防治中都起着重要作用。有研究表明，凋亡的发生需要细胞早期反应基因的表达，并且进入到S期^〔1〕。人体正常成纤维细胞离体培养一定代龄后失去增殖能力，生长达极限（Hayflick极限），成为衰老细胞。衰老并不意味着濒临死亡，如果定期更换培养液，衰老细胞仍可长期生存^〔2〕；但衰老细胞的增殖抑制是不可逆的，其生长停滞在细胞周期G₁期，不能再进入S期。这提示衰老细胞可能比增殖活跃的年轻细胞抗凋亡，从而长期维持生存。我们于1997年5月至1998年9月以体外衰老模型人二倍体成纤维细胞为对象进行了研究。

材料与方法

一、材料

1.细胞株：人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）由

卫生部北京生物制品研究所建株，30代以下为年轻细胞，其增殖能力高；55代以上为衰老细胞，3周内细胞无增殖，无可检出的³H-胸腺嘧啶掺入。本实验所用的年轻细胞为24代，衰老细胞为59代。

2.主要试剂及仪器设备：DMEM高糖培养基为美国GIBCO BRL公司产品。胎牛血清购自北京市北郊奶牛二厂。丁酸钠（sodium butyrate，NaBu）由北京大学医学部药学院合成，结构式为CH₃CH₂CH₂COONa，用作抗肿瘤药物的主要机制是抑制组蛋白去乙酰化。噻唑蓝（MTT）购自华美生物工程公司。酶标仪为德国BIO-RAD公司产品。流式细胞分析仪为美国Becton-Dickinso产品，CO₂孵箱为美国Harris公司产品。

二、方法

1.细胞培养：2BS细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，5%CO₂、37 ℃培养至接近汇合状态时传代或进行凋亡诱导。

2.NaBu作用浓度的确定及细胞生存曲线的测定：细胞接种至96孔板，每孔200 μl，培养至接近汇合状态时换含0、10、20、40、60、80、100 mmol/L不同浓度NaBu的培养基，培养72 h后用MTT法测定细胞存活率，即加MTT（5 mg/ml，溶于PBS，4℃保存） 20 μl继续培养3～4 h；吸弃培养液，加二甲亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)150 μl，吹吸数次混匀，于酶标仪上测定490 nm吸光度〔A，旧称光密度(OD)〕。每个样做3个孔，调零孔只加培养液。测定细胞生存曲线时以含50 mmol/L NaBu的培养液处理细胞0～5 d，或以无血清培养液洗5遍后用该培养液培养0～25 d，同上用MTT法测定不同时间点的细胞存活率。

3.电镜观察细胞形态变化：未诱导对照细胞及诱导后细胞分别用胰蛋白酶消化收集，送电镜室固定、包埋、切片、电镜观察并照相。

4.凋亡细胞DNA断裂的电泳分析^〔3〕：用细胞刮将每瓶细胞（约2×10⁶个）中的贴壁细胞刮下，离心收集、合并悬浮死细胞；冷PBS洗2次后悬浮于0.5 ml裂解液〔0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)〕，200 μg/ml Proteinase K，10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，100 mmol/L NaCl〕中，37℃温育并轻摇过夜；酚、酚-氯仿、氯仿各抽提1次，2倍体积无水乙醇沉淀，12 000 r/min离心10 min，回收沉淀DNA，70%乙醇洗涤，干燥后溶于20 μl Tris-EDTA缓冲液中，加RNA酶至100 μg/ml，37℃温育1～2 h。紫外分光光度计定量后4℃保存或直接电泳。电泳每个泳道上样量为10 μg，胶浓度为1.2%，电压为2～4 V/cm胶。

5.流式细胞仪检测凋亡峰（AP峰）：每个样品的贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集，悬浮细胞离心收集、合并，80%乙醇4℃固定12 h以上；冷PBS洗2次，悬浮，加入RNA酶至100 μg/ml，37℃保温30 min，用PBS调整细胞悬液浓度至10⁶ 个/ml。取1 ml经300目尼龙网过筛，碘化丙啶(PI)（1 mg/ml PI，0.1% Triton）染色，流式分析。

结果

一、NaBu作用浓度曲线

用不同浓度的NaBu处理年轻细胞72 h，由图1可见，NaBu浓度大于40 mmol/L后细胞存活率开始明显下降。为避免引起细胞坏死，取NaBu浓度50 mmol/L为凋亡诱导浓度。

二、NaBu及去血清诱导凋亡时衰老和年轻细胞的生存曲线

见图2、3。50 mmol/L的NaBu作用0～5 d，在同一时间点衰老细胞的存活率明显高于年轻细胞，年轻细胞在第3天存活率明显下降；去血清诱导0～25 d，衰老细胞的存活率亦明显高于年轻细胞，年轻细胞在第15天存活率明显下降。

图1NaBu作用浓度曲线

图250 mmol/L NaBu诱导调亡过程中年轻和衰老2BS细胞的生存曲线

图3去血清诱导调亡过程中年轻和衰老2BS细胞的生存曲线

三、凋亡时细胞形态的变化

光镜观察显示，NaBu诱导的年轻细胞在第2天就有胞浆浓缩、胞体缩小、细胞离壁漂起的现象，第3天明显，第5天加剧，并伴有细胞膜皱折、胞核裂解及细胞崩解；而NaBu诱导的衰老细胞在第5天时仅有少量出现收缩离壁的现象。去血清诱导的年轻细胞在第15天可见收缩离壁现象，而衰老细胞此时无可见变化。电镜观察凋亡早期细胞核形态变化见图4～7，NaBu诱导年轻细胞24 h后染色质浓缩凝聚、趋附于核膜，48 h后染色质进一步浓缩并断裂为点、片状，聚集于核膜下，核皱缩；而NaBu诱导的衰老细胞核48 h后无变化，直到96 h后才见染色质浓缩、断裂、附膜。

图4～750 mmol/L NaBu诱导调亡过程中2BS细胞核的形态变化图4年轻细胞诱导24 h图5年轻细胞诱导48 h图6衰老细胞诱导48 h图7衰老细胞诱导96 h

四、凋亡时细胞DNA断裂电泳图谱

见图8、9。NaBu诱导的年轻细胞在48 h出现DNA梯状断裂条带，在96 h条带浓度明显增强；而衰老细胞仅在96 h有较弱梯状断裂条带；去血清诱导的年轻细胞在第15天出现较明显的DNA梯状断裂条带，而衰老细胞此时未出现此种条带。

五、凋亡时AP峰的出现

NaBu诱导的年轻细胞在48 h出现AP峰，96 h AP峰面积所占比例达70.0%，而衰老细胞此时AP峰面积仅占23.0%；去血清诱导的年轻细胞在第15天有明显