关键词： 脑缺血；痴呆,血管性；一氧化氮；一氧化氮合酶

【摘要】目的探讨一氧化氮(NO)参与血管性痴呆（VD）形成的作用机制。方法采用改良的Pulsinelli4-血管阻断(4-VO)方法建立SD大鼠急性全脑缺血和VD模型,同时采用硝酸还原酶法(NO₂^-/NO₃^-法)测定脑缺血至痴呆形成过程中不同时点，以及分别经一氧化氮合酶抑制剂N^G位硝基左型精氨酸(L-NNA)和底物左型精氨酸(L-Arg)干预后海马区NO水平,并采用迷宫试验对各组进行行为学定量测定。结果4-VO组术后30分钟海马区NO水平明显增高，3小时达到高峰,3天后开始下降，至VD形成时又明显升高〔分别为（7.10±1.17）、（15.82±0.98）、（6.99±1.27）、（12.11±1.07）μmol/L，均为P＜0.01〕;2周左右迷宫试验提示有VD形成。L-NNA干预组和L-Arg干预组术后30分钟海马区NO水平，前者显著降低〔（1.86±0.59） μmol/L，P＜0.01〕,VD出现提前（1周左右）；而后者显著增高〔(16.25±1.17) μmol/L，P＜0.01〕,VD出现延迟（3周左右）。术后2个月时，4-VO及药物干预组学习、记忆成绩再无明显改变，且3组相近。结论NO参与了急性脑缺血及VD形成的全过程，一旦VD形成，则不论早期脑部NO水平如何，均不可逆转。

An experimental study of the nitric oxide mechanism in acute cerebral ischemia and during the process of vascular dementia formation

XU Danyun, YOU Guoxiong, MIAO Jianting, et al.^＊Department of Neurology, Chinese People's Armed Police Forces, Anhui Provincial Corps Hospital, Hefei 230041

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether nitric oxide (NO) pathway takes part in the whole process of vascular dementia (VD) formation and the mechanism of NO involved in VD.Methods Modified Pulsinelli's 4-vessel occlusion (4-VO) method was used to establish the models of acute global ischemia and vascular dementia (VD) in Sprague-Dawley (SD) rats. NO₂^-/NO₃^- method was carried out to observe the NO level changes in hippocampus in the acute stage and during the process of VD formation and after the rats were administered with nitric oxide synthase (NOS) inhibitor L-NNA and NOS substrate L-Arg respectively to compare the behavior changes.Results The 4-VO group compared with the control, the hippocampus NO level increased markedly 30 min after operation 〔(7.10±1.17)μmol/L vs (4.35±0.55)μmol/L〕. About 2 weeks after operation, VD was found in the 4-VO group. The hippocampus NO level decreased tremendously in the L-NNA-treated group〔(1.86±0.59)μmol/L〕, while increased significantly in the L-Arg-treated group〔(16.25±1.17)μmol/L〕. VD formation was shown about 1 week after operation in the former group while about 3 weeks after operation in the latter. NO level estimation showed that NO reached its highest peak 3 hours after occlusion and gradually decreased 3 days later. At the time of VD formation, it raised again to a much higher level.Conclusions NO pathway is involved in the whole process of acute ischemia up to VD formation, but it plays a different role in different stages. Whenever VD is formed, VD will become irreversible no matter what the level of NO in the early stage is.

【Key words】 Cerebral ischemia Dementia,vascular Nitric oxide Nitric-oxide synthase

近年来，一氧化氮(NO)在中枢神经系统中的病理生理作用成为神经科学研究的热点之一。NO是一种血管、神经活性物质，具有调节脑血流、促进或抑制递质释放、参与突触可塑性、神经元兴奋毒性及炎症性损害等多种作用，且与学习、记忆有关^〔1〕。NO有可能参与VD的发生,并具有重要的生理病理作用，但NO在脑缺血及VD形成过程中的机制尚不明确。我们于1996年5月至1997年4月采用改良的Pulsinelli4-血管阻断(4-VO)方法建立VD动物模型,观察脑缺血早期海马区NO的变化对VD形成的影响,脑缺血至痴呆形成过程中NO含量的动态变化，并结合药物干预试验,以期探讨NO在脑缺血和VD发生过程中的作用机制。

材料和方法

一、试剂和器材

N^G位硝基左型精氨酸(N-nitrio-L-arginine，L-NNA)、左型精氨酸(L-arginine，L-Arg)为美国Sigma公司产品；冻干硝酸还原酶、还原型辅酶Ⅱ-黄素腺嘌呤二核苷酸(NADPH-FAD)辅酶混合液、去离子水以及NO₂^-/NO₃^-比色分析试剂盒均由德国Boehringer Mannheim公司提供。三等分辐射式迷宫箱，即Y型迷宫箱由第四军医大学教保处提供，ND-82B脑电图机由上海医疗仪器厂生产，超速过滤器由美国Amicon公司生产，DG3022A型ELISA仪由南京华东电子管厂生产。

二、实验大鼠

健康、雄性SD大鼠，鼠龄4～5个月，体重250～300 g,由第四军医大学实验动物中心提供。

1.实验大鼠分组:大鼠先经Y型迷宫训练后，作预选试验,选用达预选标准的大鼠共64只，经学习、记忆测试法记录迷宫试验成绩，再随机分为4组：(1)假手术组，10只，仅暴露4条血管，不阻断血管。其中随机取5只于手术后约30分钟断头取海马检测NO₂^-/NO₃^-含量，另5只饲养作迷宫试验动态观察。(2)4-VO组，30只，反复全脑缺血再灌注，再按4-VO术后至出现学习、记忆成绩明显下降的时间长短分为以下各组：术后30分钟组，6只；术后3小时组6只；术后3天组6只；术后至出现痴呆组12只。除术后至出现痴呆组中6只术后饲养、动态观察记录迷宫试验成绩外，其他3组大鼠分别断头取海马，检测NO₂^-/NO₃^-含量。(3)L-NNA干预组12只。(4)L-Arg干预组12只。（3）、（4）两组大鼠分别给予一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NNA 50 mg/kg和底物L-Arg 40 mg/kg腹腔注射共4天，每天2次，第5天晨8∶00再注射后立即行4-VO术，于术后30分钟两组分别随机取6只大鼠断头取海马，测NO₂^-/NO₃^-含量,另6只饲养，动态观察迷宫试验成绩。

2.全脑缺血和血管性痴呆模型制作:用10％水合氯醛(0.5ml/100 g体重)腹腔麻醉,行背侧颈正中切口,暴露双侧第一颈椎横突翼小孔，用直径为0.5 mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉,造成永久性闭塞；再行腹侧颈正中切口,分离双侧颈总动脉,穿线备用。24小时后用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5分钟,缺血共3次,每次间隔1小时。术后饲养观察。

3.学习记忆测试方法:大鼠学习、记忆测定参照文献〔2〕报道的Stanes法,采用Y型迷宫箱。三臂末端小区按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂轮流作为起步区或安全区。凡大鼠受电击后能从起步区直接逃至右臂安全区的反应称为“正确反应”,否则均属“错误反应”。以达9/10正确反应标准所需电击次数表示大鼠空间分辩反应的学习记忆成绩，测试次数增多，提示学习、记忆成绩下降。先预选出达到连续2次正确反应电击次数≤3次、对电击反应较敏感的大鼠供实验用。测试时间：分别于缺血前、缺血后1周、2周、3周、1个月、2个月进行。每次测试均于上午8∶00～11∶00。4-VO术成功与否的指标为脑电图在术后2～3分钟内呈等位线且翻正反射消失。VD模型用迷宫试验定量检测确认。

三、海马区NO₂^-/NO₃^-含量测定

1.检测样品的制备:快速断头取双侧海马组织，平均湿重（180.0±9.5） mg,按1∶10(W/V)加入去离子水，冰浴匀浆10秒，4℃下超速离心(16 000 r/min)30分钟。取0.6 ml上清液，用高(30 000)、低(10 000)相对分子质量超滤器分别在室温下超速离心（16 000 r/min）过滤15和30分钟，收集滤过液备用。滤过器在使用前经检验未染有NO₂^-/NO₃^-。

2.NO₂^-/NO₃^-的含量测定按NO₂^-/NO₃^-比色分析试剂盒操作要求测定。先用硝酸还原酶行NO₃^-还原反应，再与Griess试剂反应。用DG3022A型ELISA仪在550 nm波长下测吸光度〔A，旧称光密度（OD)〕，根据建立的标准曲线计算样品中NO₂^-/NO₃^-的总含量。

四、统计学处理

实验数据以均数±标准差(±s)表示。采用方差分析或Student-Neman-Keuls检验。

结果

一、行为学测试结果

各组手术前和手术后不同阶段迷宫试验学习记忆成绩，见表1。4-VO术前各组学习记忆成绩差异无显著性(P＞0.05)。假手术组<