关键词： 胶原；自身抗体

摘要目的为了解衰老过程中细胞外基质胶原的变化，建立了血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体水平的测定方法并探讨其意义。方法采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定方法，观察108名老年人和39名中年人血清中抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体水平。参照Buyzere方法计算样品抗体水平。以混合的健康人血清作标准对照，用每份待测样品的吸光度值与标准对照的吸光度值的百分比表示抗体的相对水平。结果老年组抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体水平分别为115.5±28.6、123.2±38.0、116.5±47.6；中年组分别为98.9±7.0、106.5±27.8、97.5±28.8。两组间各项分别比较，差异均有显著性(均为P＜0.05)。结论(1)建立了血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体ELISA测定法。所测得的结果稳定、精确、重复性好。(2)老年组抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体水平均明显高于中年组。

Determination of autoantibodies to type I, IV and V collagen in serum and its value

Gao Fangkun, Chen Renshe, Li Fang, et al. Beijing Institute of Geriatrics, Ministry of Public Health， Beijing 100730

AbstractObjective To determine the serum levels of anti-collagen type I, IV and V antibodies in order to understand the changes of collagen in extracellular matrix during aging.Methods Using enzyme immunoassay, the serum levels of antibodies to type I, IV and V collagen in 108 elderly people aged 60-85 and 39 middle-aged people aged 40-59 were detected. Mixed serum from healthy donors was used as a standard. The relative antibody levels in the samples were calculated by Buyzere method and indicated by the ratio of absorbance in the sample to that in the standard.Results The levels of autoantibodies to type I, IV and V collagen were 115.5±28.6, 123.2±38.0 and 116.5±47.6, respectively, in the elderly group, and 98.9±7.0, 106.5±27.8 and 97.5±28.8, respectively, in the middle-aged group. The levels of autoantibodies to type I, IV and V collagen were all significantly higher in the elderly group than in the middle-aged group (P＜0.05).ConclusionsThe enzyme immunoassay developed by the authors for determining serum anti-collagen type I, IV and V antibody levels is reliable, accurate and repeatable. The levels of autoantibodies to type I, IV and V collagen in elderly population are higher than those in the middle-aged population.

Key Words Collagen Autoantibodies

机体衰老过程中,各器官组织发生退行性改变，细胞凋亡、萎缩，细胞外基质也出现了各种复杂的变化。为了解衰老过程中细胞外基质胶原蛋白的变化，我们建立了测定血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体的酶联免疫吸附试验，于1993年4月～1996年12月测定了108名老年人和39名中年人血清中抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体水平，并对所获结果进行了分析。

对象和方法

一、观察对象

经本院门诊体检确定的健康人147名，均做过X线胸透或拍片、心电图、B超及实验室血清学检查，除外心脑血管及肝肾疾病，抗核抗体、抗DNA抗体、血清可提取核抗原抗体均为阴性。其中老年组108名，年龄60～85岁，平均68.6岁；中年组39名，年龄40～59岁，平均48.3岁。

二、方法

标本采取方法：所有观察对象均于早晨空腹取静脉血，分离血清后立即置于-20℃保存待测，标本贮存时间不超过3个月。

材料及试剂：Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原均为美国Sigma公司产品。辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG为北京化学试剂研究所产品。包被缓冲液为含有0.05%戊二醛的磷酸盐缓冲液。稀释液为0.02mol/L PBS， pH 7.4。洗涤液为含有0.005%吐温-20的PBS。微孔反应板(8×12孔)为北京和平福利塑料板厂产品。酶标仪及洗板机均为美国Bio-Rad公司产品。

检测方法：将浓度为15mg/L的Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原包被液按每孔100μl包被微孔反应板。置于37℃温育1小时。经过3次洗涤去掉未吸附抗原，然后置于4℃过夜。次日取出反应板用洗涤液洗板后每孔加入100μl 1∶100倍稀释的待测血清。设置标准对照及空白对照孔，标准孔加入100μl混合健康人血清，空白孔加入100μl 0.02mol/L pH 7.4的PBS，然后于37 ℃温育1小时，取出后洗板，再于每孔加入100μl 1∶800稀释的酶标羊抗人IgG，于37 ℃温育1小时，取出洗板后于每孔加入底物液0.04%邻苯二胺100μl，于37℃反应10分钟，成色反应为棕红色。加入100μl 4mol/L硫酸溶液终止反应，反应稳定时间为5分钟。然后于酶标仪上测定每孔A值〔旧称光密度(OD)〕。样品抗体相对含量按照Buyzere^〔1〕的公式计算。采用t检验对所得资料进行统计处理。

结果

一、正常参考值的确定

建立了血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体ELISA测定方法，对经本院门诊体检筛选出的110名20～59岁健康人，其中男性32名，女性78名，按上述方法测定其血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体。以其平均值加2个标准差作为正常参考值上限，所得抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体上限值分别为152、155和144。为了对该方法进行评价，进一步做精密度试验，对胶原抗体含量不同的3种标本，即分为高值、中值和低值标本进行重复测定，得到批内变异系数(VC)为4%～8%，批间变异系数为7%～10%，表明该方法具有良好的重复性和较高的精密度。

将3份高值血清标本混匀后按倍比稀释，测定每一个稀释度的抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体含量，见附图，所示为抗Ⅴ型胶原抗体稀释度与A值的关系；Ⅰ型与Ⅳ型胶原抗体稀释度和A值的关系与之相似，均显示出良好的线性关系，表明该测试方法有较好的准确性。

二、中、老年人血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体水平测定与比较

147名40岁以上中、老年人血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体水平表明：中年组及老年组抗Ⅰ型胶原抗体水平分别为98.9±7.0及115.5±28.6，抗Ⅳ型抗体水平分别为106.5±27.8及123.2±38.0，抗Ⅴ型胶原抗体水平分别为97.5±28.8及116.5±47.6。两组比较3种胶原抗体水平差异均有显著性(t值分别为5.58、2.91和2.92，均为P＜0.05)。

附图抗Ⅴ型胶原抗体血清稀释度与A值关系

讨论

目前已报道的胶原有19种，临床检测中较常见的是Ⅰ～Ⅴ型胶原。由于尚无纯化的抗人胶原蛋白抗体试剂，给检测工作带来困难。我们在建立ELISA法测定血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原抗体时，参照Buyzere方法并加以改进，采用混合健康人血清作为标准对照，以每个待测样品吸光度值与标准对照的吸光度值的百分比来表示抗体的相对水平，从而消除多种原因带来的系统误差。试验的批间变异系数都在10%以下。所建立的测定血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体的ELISA方法重复性好，所测得的结果稳定、精确。

用上述方法测定的147名中、老年人血清抗Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原自身抗体水平的结果表明：老年组各类型胶原抗体水平高于中年组。这可能是衰老过程中机体免疫调控功能逐渐低下，免疫识别功能下降的一个表现^〔2〕。有报道在衰老过程中出现B细胞介导的产生特异抗体机能下降，而产生自身抗体的机能却表现为增高^〔3〕。另外，抗胶原自身抗体的变化也可能与衰老过程中胶原蛋白代谢的改变有密切关系。已有实验表明：衰老的大白鼠尾胶原蛋白非酶糖化增强形成糖基化终末产物(AGE_S)，这种老化终末产物可以与蛋白质的氨基(NH₂-)基团结合形成不可逆的交联^〔4，5〕。衰老机体的软骨胶原纤维增粗，纤维之间间隙变大，胶原纤维的耐化学性、耐热性都有明显增高，这种胶原随增龄积蓄增多而不易消化分解，也是其自身抗体增多的一个原因。目前已有一些学者开始寻找胶原自身抗体的识别位点，进一步探讨胶原与衰老和疾病的关系。

参考文献

1Buyzere ML, Scheerder IK, Delanghe JR, et al. Measurement of autoimmune response against collagen types I, Ⅲ and Ⅳ by enzymelinked immunosorbent assay, and its application in infective endocarditis. Clin Chem, 1989,35(2)：246-250.

2Katsuiku H, Masanori V, Michiyuki K. Aging and immunity. Acta Pathol Jpn, 1992,429(8):537-548.

3Zhao Keshen, Wang Yafang, Gueret R, et al. Dysregulation of the humoral immunorespones in old mice. Int Immunol, 1995,7(6)：929