关键词： 耳蜗；钾通道；老年性聋

摘要目的观察爪蟾卵母细胞表达的老年大鼠耳蜗核电压依赖性离子通道电流的变化，为研究感音神经性聋听觉中枢离子通道的变化建立方法学基础。方法分别自青年和老年大鼠耳蜗核提取多聚腺嘌呤信使核糖核酸(mRNA)，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的钾离子通道，并利用电压钳方法记录电压依赖性的离子通道电流。结果在注射老年大鼠耳蜗核mRNA的卵母细胞膜上记录到电压依赖性的钾离子通道电流最大幅度(278±37nA,16只)，明显小于青年组(364±42nA，17只，P＜0.001)。结论移植的老年大鼠耳蜗核钾离子通道功能的下降可能与老年性聋的发病有关。

Potassium channel expression in xenopus oocytes by messenger RNA from aged rat cochlear nucleus

Yang Weiping, Jiang Sichang, Yang Weiyan, et al. Institute of Otolaryngology, General Hospital of PLA, Beijing 100853

AbstractObjectiveTo detect the change of voltage-dependent on channels expressed in Xenopus oocytes by mRNA from aged rat cochlear nucleus so as to establish a methodological foundation for studying the changes of ion channels in auditory centre with sensorineural hearing loss. MethodsPoly (A)⁺mRNAs isolated from the cochlear nucleus of the adolescent(2-3 months) and aged (20-36 months) rats by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method and promega's new magesphere technique were microinjected into Xenopus laevis oocytes to express functional ion channels. Voltage clamp technique was used to record the current of voltage-dependent ion channels. ResultsVoltage-dependent potassium channel was detected from oocytes injected with adolescent and aged rat cochlear nucleus mRNA. The maximum amplitude of potassium current detected in aged group was lower than that in adolescent group (P＜0.001). ConclusionsThe result indicates that the decrease of potassium channel function in aged rat cochlear nucleus may be related to presbycusis.

Key WordsCochlear Potassium channel Presbycusis

老年性聋发病机制复杂，其病理变化不仅限于耳蜗，还存在中枢听觉通路神经元的减少和退行性变，两种变化都涉及到离子通道的改变。我们于1996年1月至1997年7月应用离子通道移植法，观察老年大鼠耳蜗核电压依赖性离子通道电流的变化并分析其原因。

材料和方法

一、大鼠耳蜗核组织的取材

Wistar大鼠(雌雄不拘)，青年组50只，2～3月龄，130～150g，购自北京动物饲养中心；老年组50只，20～36月龄，350～600g，购自解放军沈阳军区总医院实验动物科。均无强噪声及使用耳毒性药物史，处死时未发现中耳炎。青年组耳廓反射灵敏，老年组反射迟钝。1%戊巴比妥钠腹腔注射(30～40mg/kg)，麻醉后应用电反应测听仪(日本三荣7S11A型)检测听性脑干反应(ABR)阈值。随后将大鼠断头，解剖取耳蜗核组织。

二、信使核糖核酸(mRNA)的分离

采用异硫氰酸胍-苯酚氯仿法和美国Promega新磁珠技术^〔1〕，分别自青年和老年大鼠耳蜗核组织提取多聚嘌呤信使核糖核酸poly(A)⁺mRNA。UV-365型紫外分光光度计(日本岛津产)测280和260nm吸光度，计算mRNA含量。

三、卵母细胞的制备及微量注射

碎冰麻醉非洲爪蟾(中国科学院发育研究所供应)，腹部切口取卵，于MBS-H液^〔2〕中分离挑选直径1.1～1.2mm健康的Ⅰ～Ⅵ期卵母细胞，在解剖显微镜下，用改制的微量注射装置，经尖端10μm的玻璃微管对每个细胞注射50nl mRNA(1μg*μl^-1)。将注射卵置于MBS-H液中19～20℃孵育48小时。

四、离子通道反应的观察

表达mRNA的卵母细胞置于装有1ml任氏液^〔3〕的微型浴槽内，将灌充3mol*L^-1醋酸钾、尖端内径约1μm、阻抗2～4MΩ的玻璃微电极固定在微操纵器上(日本成茂WR-90)，借助显微镜将电极尖端插向细胞膜，电压钳指令电位由EPC-9型膜片钳仪(德国HEKA electronik)产生并记录电流反应，利用M2 LAB分析软件(美国Instrutech cORP)在Atari MEGA 4微机(美国Atari COPR)上进行数据分析。

结果

一、不同月龄大鼠ABR阈值检测

青年组100耳，ABR阈值为25.6±7.2dB声压级(SPL)，老年组100耳为77.1±12.4dB sPL，老年组听阈较青年组增高，差异有极显著性(t检验，P＜0.001)。

二、大鼠耳蜗核poly(A)⁺mRNA的提取

实验测得青年和老年大鼠耳蜗核提取的poly(A)⁺mRNA的A_260nm/A_280nm比值〔A为吸光度，旧称光密度(OD)〕均为2.0，表明样品中蛋白质基本除净。每克大鼠耳蜗核组织提取的poly(A)⁺mRNA为20～24μg。

三、大鼠耳蜗核电压门控钾通道的表达

为排除爪蟾卵母细胞自身存在的内源性离子通道电流对表达的外源性离子通道电流的影响，首先对未注射mRNA的对照组卵母细胞进行内源性离子通道电流的分析，结果显示爪蟾卵母细胞本身基本没有电压依赖性的内向电流，而电压依赖性的外向电流最大幅度为57±12nA(16只)。注射青年和老年大鼠耳蜗核mRNA的爪蟾卵母细胞电压钳位于-100mV，以10mV的阶跃给细胞一串去极化刺激，当去极化达到-30mV时，细胞开始产生一个时程较长的外向电流，此电流幅度随去极化电压的增大而增高。当卵母细胞膜去极化至+30～+50mV时，外向电流幅度达最大值，青年组为364±42nA(17只)，老年组为278±37nA(16只)，见附图，两组差异有极显著性(t检验，P＜0.001)。为确定外向电流的性质，分别在细胞外液中加入终浓度为1mmol*L^-1的钠离子通道阻断剂河豚毒素(TTX)和10mmol*L^-1钙离子阻断剂MnCl₂，该电流幅度无变化，当加入终浓度为20mmol*L^-1的钾离子通道阻断剂氯化四己胺(TEA)，20～30秒钟后电流反应消失。根据该电流激活阈值较高、上升快速、失活缓慢、对TEA敏感等特点，疑为瞬间外向钾电流(I_A)。

附图在注射青年和老年大鼠耳蜗核mRNA的卵母细胞膜上记录到的电压依赖性的钾电流

讨论

本实验分别对50只青年大鼠和50只老年大鼠听性脑干反应阈值检测的结果显示：老年组听阈明显高于青年组，表明老年大鼠听功能下降。

钾离子通道分为电压依赖性、受体、第二信使、配体激活性和Ca、Na激活性等十几种亚型^〔4〕。延迟整流钾离子通道电流(I_K)和I_A都属于电压依赖性的外向膜电流，前者缓慢激活、缓慢失活，后者快速上升、快速下降。本实验在注射大鼠耳蜗核mRNA的爪蟾卵母细胞膜上记录到电压依赖性外向钾离子通道电流既具有I_A快速上升又具有I_K缓慢失活的特征，根据有关钾离子通道电流分类报道，判断为I_A^〔5〕。注射老年大鼠耳蜗核mRNA的卵母细胞电压依赖性钾离子通道电流幅度减少，提示移植的老年大鼠耳蜗核钾离子通道功能下降，可能由于老年大鼠增龄性基因调控障碍，使通道蛋白发生基因或转录水平的变化，导致初级听觉中枢电信号传递和整合效应下降。

自从1982年Miledi等^〔6〕发现外源mRNA经卵母细胞自身的蛋白合成系统可以在卵母细胞膜上产生有功能的受体和离子通道以来，此种方法在研究神经递质受体及离子通道的结构、功能、理化特性及药理作用方面起到了很大的作用^〔7〕。本实验利用这一模型，将存在于听觉中枢中难以用电生理方法加以分析研究的离子通道移植到卵母细胞膜上，从细胞和分子水平研究老年性聋听觉中枢离子通道的改变，其方法学意义为：表达在卵母细胞上的听觉中枢离子通道易于进行电生理观察，可以从结构和功能两方面研究分析耳蜗核离子通道的特性，便于体外观察药物对离子通道的直接作用，为研究感音神经性聋离子通道反应性的变化、分析其原因、发现有效治疗新药开辟了一条新的研究途径。

国家自然科学基金资助项目(39470746)

参考文献

1王升启，朱元晓，汲言山.核酸纯化技术.见：孙志贤，主编.现代生物化学理论与研究技术.北京：军事医学科学出版社，1994，425-431.

2姚永，朱辉，杨又山，等.大鼠脑mRNA在爪蟾卵母细胞内表达的电压门控钙通道的电压钳研究.生理学报，1993，45：44-45.

3Carpenter MK, Parker I, Mi