关键词： 脑组织移植；帕金森病/治疗；神经节，交感

摘要目的探索帕金森病外科治疗的移植方法，并为培养交感神经节移植脑内能否长期存活寻找组织学证据。方法用1甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱发猴帕金森病模型11只，将自体腓神经培养24～28天所得的雪旺细胞与神经节组织共同培养后行脑尾状核移植，观察2年后取标本，用乙醛酸诱发多巴胺荧光和免疫组织化学方法检测。结果猴帕金森病症状明显好转，移植2年后脑尾状核仍可见存活的神经节细胞，移植物与脑组织间有轴、树突联系，多巴胺荧光及神经丝蛋白、突触素、铬粒素等染色阳性。结论神经节与雪旺细胞共同培养后移植脑内可存活2年，是治疗帕金森病的较好方法。组织学观察结合荧光及免疫组织化学染色结果是判定移植物存活与否的重要手段。

An experimental study on the transplantation of cultured cervical sympathetic ganglion into brain for treatment Parkinson's disease in monkeys

Gao Zhixue, liu Yansheng， Yang Li, et al.Department of pathology, Kunming General Hospital, Chengdu Military Command, Kunming 650032

AbstractObjectiveTo study a transplantation method in surgical treatment of Parkinson's disease and find the histological evidence for survival of transplanted cultured ganglion in brain.MethodsParkinson's disease model was induced by N-methy1-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropynidine(MPTP) in 11 monkeys. Schwann's cells (obtained from 24-28 days cultured fibularis nerve were cultured with ganglion tissue) and transplanted at caudate nucleus in brain. After 2 years observation specimens were taken for glyoxylic acid induced dopamine fluorescence and immunohistochemical examination.ResultsThe symptoms of Parkinson,s disease improved obviously. Two years after transplantation, there were still living ganglion cells at the caudate nucleus and neurites between the brain tissue and graft showing dopamine fluorescence, chromograin A, synaptophysin and neurofilament positive.ConclusionsCultured ganglion with Schwann's cells transplanted in brain can survive 2 years, sympathetic ganglion may be superior to other tissue as graft for treating parkinson's disease. Histological observation combined with fluroescence and immunohistochemistry is important method for judging the survival of transplanted graft.

Key WordsBrain tissus transplantation Parkinson's disease Ganglion, sympathetic

猴颈交感神经节移植治疗帕金森病的研究较少，且缺乏组织学形态资料。我们于1993年6月至1997年4月用恒河猴诱发帕金森病模型，取自体颈交感神经节培养后移植脑内，观察移植后2年猴的行为改变，并从组织形态学方面为神经组织移植寻找客观指标，探索帕金森病的移植治疗方法。

材料与方法

一、实验动物及帕金森病模型的建立

健康2～7岁恒河猴11只，体重5.0～10.5kg，雌雄不限，同种饲料喂养。5%硫喷妥钠腹腔麻醉后暴露一侧颈总动脉并夹闭颈外动脉，按0.3mg/kg体重1甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)50ml生理盐水稀释后自颈内动脉缓慢注入。1周后猴的患肢屈曲，唇及肢端运动性震颤，表情呆滞，动作迟缓，记录其双侧大鱼际肌及胫前肌的肌电图符合帕金森病改变。以9只为移植组，2只为对照组。

二、神经组织培养及移植

猴模型建成后1个月，无菌条件下取猴一侧腓总神经3～4cm用Hank液反复清洗，解剖显微镜下剥弃结缔组织及神经外膜，剪成0.5mm小段贴于涂过鼠尾胶的50ml干燥无菌瓶底，加适量培养液(PRM1640 20%牛血清、青霉素、链霉素各100U/ml)，置37℃、5%CO₂培养，隔日换培养液，5～7天组织块周围长出细胞融合，0.125%胰蛋白酶加0.01%EDTA消化传代，按差速贴壁法选择雪旺细胞传代培养，并用阿糖胞苷处理得到纯化的雪旺细胞，24～28天后用免疫组织化学标记S-100及Vimentin,计数S-100阳性而Vimentin阴性的细胞，雪旺细胞可达92%^〔1〕。

帕金森病猴于模型建成后2个月，常规麻醉后在一侧颈总动脉分叉上2～5mm处取颈交感神经节，显微镜下尽量切弃结缔组织及神经外膜，切成20～40块50～100μm的小段，与雪旺细胞共同培养5天后离心，用套管针将移植物按猴尾状核头部坐标定位植入颅内，留针5分钟后拔针缝合；对照组以小腿肌腱碎片用同法植入。当天CT头颅扫描了解植入情况。

三、移植后2年标本收集

1.猴麻醉后结扎颈外动脉，颈内动脉插管用2%乙醛酸泰洛液250ml灌注，再灌注铝甲醛蔗糖液300ml。取脑移植区2cm×2cm×2cm组织，-27℃连续冰冻切片(7～10μm)备用。

2.免疫组织化学染色按ABC法，一抗为铬粒素、神经丝蛋白、突触素、S-100蛋白、神经胶质酸性蛋白(GFAP)，均为丹麦Dako产品。

3.乙醛酸诱发多巴胺荧光：10μm切片置干燥器内24小时后，用相对湿度70%的多聚甲醛80℃作用1小时，石蜡油封片，荧光显微镜观察(BG滤镜，波长410μm)，空白对照及水淬灭荧光法鉴别多巴胺荧光及组织自发荧光^〔2〕(试剂均为美国Sigma产品)。

结果

一、猴行为症状的改变

注射MPTP后1周出现帕金森病症状，移植当天CT扫描发现术侧颅内有低密度圆形区域。移植后1个月帕金森病症状减轻，2个月后又出现震颤，与MPTP后1周无明显区别，但3、4个月后症状减退，半年后基本恢复正常，已无震颤，表情丰富。对照组猴仍有不规则震颤及表情呆滞，寻食能力差，有1只于术后10个月死亡。

二、病理学观察

1.移植后2年猴脑表面软脑膜可见瘢痕存留，移植组及对照组猴脑组织切片均可见组织水肿、淋巴细胞及浆细胞浸润、结缔组织增生、胶质增生、组织坏死后空腔形成。神经节移植组可见数量不等(与正常神经节对照明显减少)的椭圆形、多角形大细胞，胞浆颗粒状，核小而圆或椭圆形、偏位，细胞外周空晕并有较小的椭圆形卫星细胞(图1)，这些细胞与正常神经节细胞(图2)比较，其大小、形态相似；而对照组无此类细胞，且坏死空腔较大。

2.免疫组织化学染色：移植组大细胞(节细胞)铬粒素、突触素及神经丝蛋白阳性(图3)，移植物与脑组织交界处可见具有一定方向性阳性丝状结构(图4)，其余小细胞S-100、GFAP阳性。

3.多巴胺荧光：移植物中可见不均匀的点、片状荧光团，与脑组织交界区域有纤维样荧光(图5，6)。

讨论

帕金森病的治疗主要是补充多巴胺类药物，以减轻震颤麻痹症状。有报道用肾上腺髓质及人胚胎脑组织移植治疗帕金森病有效^〔3〕。板仓澈等^〔4〕用猴颈上交感神经节移植观察1年6个月，乙醛酸诱发多巴胺荧光结果表明移植物存活，并与宿主脑整合。本实验采用植块改良法培养雪旺细胞，并与自体交感神经节培养后移植观察2年结果表明：移植区域的细胞与颈交感神经节的细胞形态相似，但数量减少。免疫组织化学染色结果提示移植区的两类细胞分别是神经节细胞及其卫星细胞(雪旺细胞)。突触素及多巴胺荧光阳性则提示移植物与宿主脑之间具有功能联系，表明移植2年后不但有细胞存活，而且有功能通路建立，移植后猴的行为变化规律亦支持这一结论。近年的研究发现中枢神经本身具有再生能力，在外周神经提供的微环境中，中枢神经的轴、树突可再生、出芽或建立侧支^〔5〕。Berry等^〔6〕将纯化的雪旺细胞植入中枢神经，发现其轴突可长入植入物。本实验用自体的雪旺细胞与神经节培养后植入，其理论依据就是雪旺细胞能为神经元提供相应的营养因子，具有促进再生的作用^〔7〕；它既为移植神经节提供了在中枢神经组织内存活的微环境，同时也产生神经生长因子，对帕金森病的主要病变——中脑核质神经元变性具有抗损伤作用^〔8〕。培养的雪旺细胞与神经节共同移植可能更易于存活或存活时间更长，对帕金森病症状有长期的改善作用(2年以上)。从神经再生的分子生物学基础看，神经节移植优于肾上腺髓质及胚胎脑组织移植。我们认为在神经移植物的检测方面，除应用组织化学、免疫组织化学及荧光等方法观察确定移植物的细胞来源及神经生物学功能外，还应对移植物长期进行组织学追踪观察，了解移植物是否存活。雪旺细胞与神经节培养后移植对神经元再生有一定促进作用，但方法仍需改进。

图1猴神经节脑尾状核移杆2年，可见散在多角形、椭圆形大细胞，↑神经节细胞，卫星细胞HE×400图2猴政党神经组织<