关键词： 抑癌基因；平滑肌；衰老

摘要目的观察腺病毒载体介导的人野生型Rb基因导入后促进血管平滑肌细胞衰老的作用，并探讨Rb基因抑制平滑肌细胞增生的机理。方法用外源性Rb基因重组腺病毒载体感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞。以细胞超微结构、³H-胸腺嘧啶核苷掺入、流式细胞术分析细胞周期和β-半乳糖苷酶染色等方法观察平滑肌细胞的衰老变化。结果Rb基因导入可使平滑肌细胞发生衰老，表现为细胞线粒体肿胀，脂褐素堆积，DNA合成减少，细胞停滞在G₀/G₁期，与衰老相关的β-半乳糖苷酶表达增加。

结论野生型Rb基因通过促进细胞衰老而对平滑肌细胞增生起抑制作用。

Promotion of the senescence of vascular smooth muscle cells by the introduction of retinoblastoma gene

Wang Shu, Tang Weiqing, Li Jian. Department of Biochemistry, Beijing Institute of Geriatrics, Beijing 100730

AbstractObjectiveTo observe the promotion of the senescence of vascular smooth muscle cells (SMC) after the introduction of retinoblastoma (Rb) gene via a recombinant adenovirus vector and to explore the mechanism of inhibition of SMC proliferation by wild-type Rb gene.MethodsA replication-deficient adenovirus vector encoding a wild-type Rb was constructed to infect the cultured rabbit aortic SMC. The senescent changes of SMC were observed with transmission electron microscope, ³H-thymidine incorporation test, β-galactosidase stain and cell cycle analysis with flow cytometry.Results Introduction of wild-type Rb gene into SMC could arrest the cells at G₀/G₁ phase of the cell cycle and lead to inhibition of DNA synthesis.The senescent SMC showed swelling of mitochondria, accumulation of lipofuscin and positive senescence-associated β-galactosidase stain.ConclusionsThe results demonstrate that the wild-type Rb gene suppresses SMC proliferation by promotion of cell senescence.

Key Words Gene,suppressor,tumor Smooth muscle Senescence

视网膜母细胞瘤(Rb)基因是主要的抑癌基因之一，在细胞生长过程中发挥重要的调节作用。在因动脉内皮损伤而引起血管平滑肌细胞(SMC)过度增生的情况下，内源性Rb基因由于磷酸化而失去抑制细胞生长的作用^〔1〕。我室曾用腺病毒载体将外源性Rb基因导入血管

国家自然科学基金项目(39570775)与卫生部优秀中青年人才专项基金资助项目SMC，结果表明Rb基因导入可抑制SMC的增生^〔2〕。因此将外源基因导入SMC，有可能成为动脉粥样硬化和血管再狭窄的基因治疗方法。在此基础上，我们于1997年2～6月从Rb基因促进兔SMC衰老这一角度进一步探讨Rb基因抑制SMC增生的机理。

材料与方法

一、野生型Rb基因重组腺病毒载体的构建

将编码全长Rb蛋白的人Rb互补脱氧核糖核酸(cDNA，3549bp，由美国德州大学MD Anderson肿瘤中心赠送)插入PRC/CMV载体(美国Invitrogen产品)，酶切和回收含有CMV启动子、Rb cDNA片段。将此片段插入腺病毒质粒载体PXCJL-1的BamH₁位点。由于此质粒只含小片段的腺病毒基因组，需要与含有大片段腺病毒基因组的另一质粒PJM17共转染293辅助细胞，在细胞内两质粒同源重组为E₁区缺失的、含有外源基因的腺病毒片段。筛选并克隆复制缺陷型重组腺病毒载体。作为对照载体的含有LacZ基因的重组腺病毒载体以同样方法构建。

二、方法

1.兔主动脉SMC的培养：按Campbell^〔3〕贴块法进行。无菌操作下取出胸主动脉，剥出中膜，剪成1～2mm长的碎片，接种于培养瓶中，用含20%胎牛血清的DMEM培养基(均为美国GIBCO产品)进行培养，待细胞长至完全汇合后传代培养。

2.SMC的³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)掺入实验：将5×10⁴SMC接种于24孔培养板，生长20小时后换无血清DMEM培养基继续培养72小时，用重组腺病毒载体感染24小时，换含10%胎牛血清的DMEM继续培养24、48、72小时。检测前4小时每孔加入2.5μl ³H-TdR(3.7GBq/ml，中国原子能科学研究院产品)。收集细胞，破膜，液闪测量。

3.SMC的超微结构观察：用细胞刮子刮下已导入外源性Rb基因的SMC，3 000r/min离心20分钟，弃上清，2.5%戊二醛和1%锇酸分别固定20分钟，逐级乙醇脱水，812树脂包埋，切片，透射电镜(日本JOEL产品)观察。

4.流式细胞仪分析细胞周期：SMC在无血清DMEM中培养24小时，外源性Rb基因重组腺病毒载体感染48小时，换含10%胎牛血清的DMEM继续培养24小时，收集细胞，核糖核酸(RNA)酶37℃处理1小时，碘化丙啶4℃避光染色后行流式细胞仪(美国BD公司生产，FACS420)分析。

5.β-半乳糖苷酶(β-gal)染色：按Dimri等^〔4〕建立的方法进行。将SMC接种于盖玻片上。转染Rb基因重组病毒载体72小时，固定细胞，用X-半乳糖苷酶(X-gal)染液，37℃保温4～8小时。染液含20mmol/LX-gal、40mmol/L醋酸-磷酸钠(pH6.0)、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾、150mmol/L氯化钠、2mmol/L氯化镁。

结果

一、外源性Rb基因导入引起SMC超微结构的变化

SMC核膜内陷形成皱壁，线粒体肿胀，内质网扩张呈空泡状，出现大量脂褐素(图1)。

二、外源性Rb基因导入对SMC DNA合成的影响

见图2，可见SMC在无血清条件下培养72小时后³H-TdR的掺入量处于较低水平(见图中0小时)；但在加入10%胎牛血清24小时后，由于SMC增生导致³H-TdR掺入量显著升高。然而，与正常SMC相比，感染Rb基因重组病毒者的³H-TdR掺入量仍处于明显减少状态。72小时后，³H-TdR掺入的抑制率为67.7%(t检验，P＜0.01)。提示导入外源性Rb

V₁：正常的SMC

V₂：LacZ基因重组腺病毒转染的SMC

V₃：Rb基因重组腺病毒转染的SMC

图2外源性Rb基因导入对SMC³H-TdR掺入的影响

图中各值是3次测定结果的平均值

基因，可使细胞DNA合成减少。此外，单纯导入含LacZ基因的腺病毒载体不抑制SMC的³H-TdR掺入，表明DNA合成的降低是由野生型Rb基因引起的，而与病毒载体无关。

三、外源性Rb基因导入对SMC细胞周期的影响

见图3，表明SMC在无血清DMEM中培养72小时后生长停滞，86%SMC处于G₀/G₁期；加入胎牛血清后，约50%的SMC还停留在G₀/G₁期；Rb基因重组腺病毒感染的SMC在血清作用下，有约80%的细胞仍停留在G₀/G₁期。表明Rb基因有阻断细胞周期的作用。

A：无血清培养72小时的SMC

B：加入胎牛血清刺激的对照SMC

C：加入胎牛血清刺激的Rb基因重组腺病毒感染的SMC

图3外源性Rb基因导入对SMC细胞周期的影响

四、外源性Rb基因导入对SMC β-gal染色的影响

分别对SMC培养第2代、第12代、Rb基因重组腺病毒感染的第2代SMC进行β-gal染色。结果显示正常生长的第2代SMC为阴性显色(图4A)，第12代SMC呈现阳性(图4B)，外源性Rb基因导入的第2代SMC也出现β-gal阳性反应(图4C)。表明野生型Rb基因可以促进SMC的衰老。

讨论

Rb基因是细胞周期调控与细胞分化中的重要调控因子。Rb基因通过与细胞内调控成分和细胞蛋白相互作用控制细胞的生长和分化，同时Rb基因又受细胞内外多种因子的调控，使Rb基因的功能与细胞生长、分化状态相适应^〔5，6〕。Rb基因有磷酸化和非磷酸化两种形式。非磷酸化Rb基因是Rb基因的活性形式，存在于G₀期和G₁期细胞中；磷酸化Rb基因则存在于S期和G₂期细胞中。Rb基因只在G₁期发挥调控细胞生长的作用；磷酸化后便失去这种作用。Rb基因磷酸化过程与细胞中cdc2基因及周期蛋白有关。cdc2基因编码是一种称为P34^cdc2的蛋白激酶，Rb基因是P34^cdc2的底物。研究表<