关键词： 帕金森病；脱噬作用；PC12细胞

摘要目的研究帕金森病(PD)黑质多巴胺神经元的死亡机理。方法用脱氧核糖核酸(DNA)标记法，借助流式细胞仪和荧光显微镜观察多巴胺(DA)对大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡的影响。结果DA可诱发PC12细胞凋亡，适中浓度(0.45mmol/L)时PC12细胞凋亡数最多(凋亡率为48.7%±6.3%)；抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)可部分阻止DA诱发的PC12细胞凋亡(P＜0.01)。

结论细胞凋亡参与了PD的病变过程，采用适当的抗氧化剂可能有益于PD的治疗。

The effect of dopamine on apoptosis in pheochromocytoma cells

Zhou guoqing, Zhou Xiaoda, Li ningli, et al. Department of neurology, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001

AbstractObjectiveTo study the mechanism of dopaminergic neuronal death in substantia nigra of parkinson's disease (PD).MethodsUsing the DNA end-labeling method the effect of dopamine (DA) on rat apoptotic PC12 cells was examined by flow cytometry and fluorescence microscopy.ResultsDA induced apoptosis in PC12 cells. Moderate concentration of DA (0.45mmol/L) gave maximal number of apoptotic cells with a rate of apoptosis 48.7%±6.3%; and the antoxidant dithiothreitol (DTT) partially blocked DA-induced apoptosis in PC12 cells (P＜0.01).ConclusionsApoptosis may be involved in the pathogenesis of PD, and treatment with proper antioxidants may be useful in PD therapy.

Key WordsParkinson disease Apoptosis PC12 cell

帕金森病(PD)黑质多巴胺神经元损害的原因迄今尚不明确，现认为脑内神经递质多巴胺(DA)代谢产生的反应性自由基起重要作用^〔1〕。细胞凋亡是神经系统发育过程中过剩细胞选择性死亡的主要生理方式，它可能也参与了PD的病变过程^〔2〕。大鼠嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma cell, PC12)的PC12细胞株被广泛用于神经细胞死亡方式及毒性损害的研究。我们于1997年2～4月观察DA对PC12细胞凋亡的影响，以探讨PD的发病机理。

材料与方法

一、细胞培养

PC12细胞株(中国科学院上海细胞所)置于DMEM(美国GIBCO公司)培养液中，内含8%胎牛血清、8%马血清、谷氨酰胺2mmol/L、青霉素50U/ml及链毒素25μg/ml。细胞培养瓶预先铺以0.2mg/ml的鼠尾胶，用于细胞传代培养。

二、加入DA处理

将PC12细胞置于铺过鼠胶的96孔板内培养，将细胞浓度调整为1×10⁶/ml。当细胞生长活力良好时加入DA，使DA的终浓度分别达到0.15、0.30、0.45及0.60mmol/L；对照组加DMEM液。每个浓度组及对照组各占3个孔板。放入5%CO₂孵箱，在37℃条件下培养24小时。

三、脱氧核糖核酸(DNA)末端标记、荧光显微镜计数凋亡细胞

向细胞沉淀中加含有1%甲醛的PBS液1ml，4℃条件下放置30分钟。然后用PBS液洗涤2次，加入0.5μg末端转移酶(美国Sigma公司)，0.5×10^-6mol/L的b-16-dUTP(美国Sigma公司)，37℃条件下30分钟后，加入亲和素标记的异硫氰酸荧光素。发生凋亡的细胞DNA出现断裂，可被dUTP标记，在流式细胞仪或荧光显微镜下呈荧光阳性。使用OLYMPUS荧光显微镜检测涂在薄片上的凋亡细胞。每个孔板随机取10个视野，用荧光显微镜计数凋亡细胞，用光镜计数每个视野的细胞总数，求出每个孔板内凋亡细胞的百分比。

四、二硫苏糖醇(DTT)对DA诱发PC12细胞凋亡的影响

PC12细胞放置24孔板内进行培养，将细胞浓度调至1×10⁶/ml后，再加入DA及DTT。使DA终浓度为0.30mmol/L，DTT终浓度为10mmol/L。本试验共分3组：DA组(0.30mmol/L)、DA(0.30mmol/L)加DTT(10mmol/L)组及对照组(加DMEM液)，每组均占4个孔板。在37℃，5%CO₂孵箱内培养24小时后进行DNA末端标记(方法同前)。再用流式细胞仪(美国Becton dikson公司)检测每个孔板内的凋亡细胞的百分比，每个孔板共计数20000个细胞。

五、统计分析

数据以均数±标准差(x±s)表示，用t检验处理。

结果

一、DA对PC12细胞凋亡的影响

DA浓度为0.15、0.30、0.45、0.60mmol/L时，其诱导PC12细胞凋亡的百分比分别为21.4%±4.9%、43.9%±6.1%、48.7%±6.3%、36.9%±5.9%，对照组为1.8%±0.5%。

二、DTT对DA诱发PC12细胞凋亡的影响

对照组、DA(0.30mmol/L)组、DA(0.30mmol/L)加DTT(10mmol/L)组的凋亡百分率分别为2.3%±0.8%、42.2%±7.4%、23.2%±4.9%。DA加DTT组与对照组和DA组比较，差异均有显著性(P＜0.01)。

讨论

凋亡是由遗传控制的主动细胞死亡过程，主要表现为细胞皱缩、核DNA断裂，而细胞膜相对完整。由于不伴有炎性反应，因而不影响邻近细胞。凋亡是中枢神经系统发育过程中多余细胞选择性死亡的主要方式，最近认为它可能也参与了神经变性病的病变过程^〔3〕。Ziv等^〔4〕用DA诱发出鸡胚交感神经元凋亡，提出凋亡是PD发病的新的机理。Fehsel等^〔5〕于1991年首次用末端转移酶标记DNA缺口，用以检测细胞凋亡。该方法特异性强，已被广泛使用。PC12细胞是儿茶酚胺细胞株，为研究神经细胞死亡方式及神经毒理的有用工具^〔6〕。本实验用此方法，结果表明DA可诱导PC12细胞凋亡，当其在适中浓度时细胞凋亡数最多。正常人体内存在神经细胞的相互联系，抗氧化功能及细胞修复机理，这些可能阻止了DA诱发的黑质多巴胺神经元凋亡。当先天或后天因素使凋亡控制环节紊乱时，黑质细胞发生凋亡，进而导致PD的发生。凋亡容易解释PD这种慢性变性病的病理特点，即进行性选择性神经元损害，而不伴有炎性反应。

DA诱发PC12细胞凋亡的机理还不清楚。DTT是一种巯基类抗氧化剂，可以清除羟自由基、氧自由基及过氧化氢^〔7〕。本实验中，DTT可以部分阻止DA诱发的PC12细胞凋亡表明，DA引起细胞凋亡可能是通过反应性自由基实现的。目前PD发生凋亡的直接证据尚不多。Hartely等^〔2〕发现，黑质神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)低剂量时诱导PC12凋亡，高剂量则主要引起细胞坏死。我们提出，凋亡发生于PD早期，晚期黑质神经元坏死并伴胶质细胞增生。本实验中，适中浓度的DA诱导细胞凋亡数最多支持这一观点。因此我们认为，早期采用适当的抗氧化类药物有益于PD的治疗。进一步深入研究凋亡在黑质变性中的作用可能为PD的治疗提供新线索。

参考文献

1Gotz ME, Kunig G, Riederer P, et al. Oxidative stress: free radical production in neural degeneration. Pharmacol Ther, 1994,63:37-122.

2Hartely A, Stone JM, Heron C, et al. complex I inhibitors induce dose dependent apoptosis in PC12 cell: relevance to parkinson's disease. J Neurochem, 1994, 63:1987-1990.

3Faff MG, Barres BA, Burne JF, et al. programmed cell death and the control of cell survival: lesson from the nervous system. Science, 1993, 262:695-700.

4Ziv I, Melamed E, Nardi N, et al. dopamine induces apoptosis-like cell death in cultrued chick sympathetic neurons: a possible novel pathogenetic mechanism in Parkinson's disease. neurosci Lett, 1994, 170:136-140.

5Fehsel K, Kolb BV, Kolb HI, et al. analysis of TNF-induced DNA strand breaks at the single cell level. Am J Pathol,1991,139: 251-259.

6Estrvez AG, Radi R, Barbeito L, et al. peroxynitrite-induced cytotoxicity in PC12 cells: evidence for an apoptotic mechanism differentially modulated by neurotrophic factors. J Neurochem, 1995,65:1543-1550.

7Aruma OL, Halliwell B, Hoey BM, et al. the antoxidant action of N-acetylcystein: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. Free Rad Biol Med,1990,12:593-597.