【摘要】目的探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关抗原蛋白酶-3(PR-3)对体外培养人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响及诱导机制。方法采用ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿外周血中性粒细胞分离纯化其细胞质中PR-3，并用该蛋白酶诱导培养人胎肾内皮细胞发生凋亡。观察不同剂量PR-3于不同时间点对内皮细胞存活情况及其形态学变化的影响。用碘化丙啶染色DNA以评价凋亡的发生率，观察核染色质固缩及DNA片段的形成。用琼脂糖凝胶电泳确定凋亡小体的形成和凋亡梯形。结果ANCA阳性SLE患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3以剂量、时间依赖性形式诱导人胎肾内皮细胞发生凋亡［PR-3 10 μg·ml^－1.24h^－1细胞凋亡率为(75.5±26.5)%］，与阴性对照组［(1.8±1.2)%］比较差异有显著性(P＜0.01)。凋亡的内皮细胞与培养基分离、悬浮、呈碘化丙啶强染的大小不等的碎片，核染色体固缩。DNA电泳提示凋亡核小体形成，出现凋亡梯形。结论中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3可诱导胎肾内皮细胞凋亡，在ANCA相关性血管炎性疾病的发生发展中可能具有重要的病理生理意义。

Apoptosis of human fetal glomerular endothelial cell induced by neutrophil proteinase-3 from ANCA positive children with SLE

MA HongWANG CuilingLIU Yuan

（Department of Pediatrics,First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether the neutrophil serine proteinase-3 (PR-3),a specific autoantigen of C-ANCA,could induce human fetal glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.MethodsPR-3 was isolated from polymorphonuclear leukocytes obtained from C-ANCA-positive children with SLE.The cultured glomerular endothelial cells from human fetal kidneys were treated with PR-3 and apoptosis was assessed by different methods including the propidium iodide staining,DNA fragmentation analysis,and morphology observation.ResultsPercentage of apoptotic cells significantly increased (P＜0.01) with 10 μg/ml PR-3 at hour 24 after treatment.Values at this time point were (75.5±26.5)% for PR-3 group and (1.8±1.2)% for negative control,demonstrating an increase of apoptosis in a dose- and time-dependent manner with the highest values achieved at hour 24.The apoptosis features appeared as nuclei condensation and DNA fragmentation,and typical DNA laddering was apparent in cells treated with PR-3 and in positive control cells treated with TNF-α.ConclusionThe results suggest that PR-3 may directly induce glomerular endothelial cell apoptosis in vitro.This pathogenic role of PR-3 may be an important machanism of injury in anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated vasculitic diseases in children.

【Key words】Antineutrophil cytoplasmic antibody;Peptide peptidohydrolases;Lupus erythematosus,systemic;Kidney glomerulus;Apoptosis

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)已被作为血管炎相关疾病标记抗体用于临床诊断和疗效评价^［1，2］。研究证实，在ANCA相关性血管炎病损过程中，被活化的中性粒细胞胞浆蛋白酶可致血管内皮损伤和细胞溶解^［1，2］，但有关机制尚不完全清楚。本文探讨ANCA阳性系统性红斑狼疮(SLE)患儿中性粒细胞胞浆蛋白酶-3(PR-3)对体外培养的人胎儿肾小球内皮细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1PR-3的分离制备

采集16例ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离多核白细胞，－70 ℃保存。按Ewert等^［3］方法从多核白细胞中空化沉淀中性粒细胞胞浆蛋白酶。参照Jia-Jin等^［1］方法分离中性粒细胞胞浆蛋白酶-3，用抗PR-3 ELISA法识别。用SDS-PAGE分离纯化PR-3，并用ELISA法使PR-3与小鼠抗人单抗和兔抗人多抗发生反应，并识别酶活性^［1］。

1.2人胎儿肾小球内皮细胞分离及培养

5个月引产人胎儿，分离摘取肾脏，剪切肾皮质成小碎块，于250、106 μm不锈钢筛网中轻研肾皮质，于75 μm筛网收集纯净肾小球，离心，用Ⅴ型胶原酶消化离散细胞，用10%FCS及RPMI 1640液终止。将上清液再离心，收集沉淀物并加入内皮细胞培养液^［4］，于25 cm²培养瓶中，37 ℃，5% CO₂孵育箱中孵育72 h，观察细胞生长情况，于10 d时传代，用第4～5代培养内皮细胞进行实验，每瓶加8 ml基质，2×10⁶细胞量，分别移入48孔细胞培养盘中，每孔细胞密度为2×10⁴、基质0.5 ml，并孵育使细胞融合24 h，用无血清RPMI 1640使细胞同步12 h^{［1，2，4］}。培养内皮细胞随机分组，分别用1、5、10 μg/ml的PR-3处理并与 细胞共同培养6、12、24 h，同时设阳性对照组：用20 ng/ml重组TNF-α(处理6、12、24 h)，阴性对照组用PBS处理。并于各时间点观察各组细胞生存情况，比较各组凋亡的百分率。

1.3人胎肾小球内皮细胞凋亡的测定

1.3.1用琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段：参照文献［1-3］方法，裂解内皮细胞，用酚∶氯仿(1∶1)及氯仿分别抽提DNA溶液，用酒精沉淀，双蒸水溶解，用10 μg/ml DNA酶消化6 h。加样DNA为6 μg/每泳道于1.5%琼脂糖凝胶中，于含1 μg/ml溴化乙啶的TBE缓冲液中，100 V电泳40 min分离DNA片段。紫外线显影DNA片段，用单克隆抗DNA-过氧化酶作偶联液与DNA片段样品液反应，在405 nm处读出光密度值。

1.3.2用碘化丙啶染色评价肾小球内皮细胞凋亡：收集经PR-3、TNF-α及PBS处理的培养内皮细胞，甲醇固定，用碘化丙啶(50 μg/ml)加入RNase-A(10 mg/ml)，于37 ℃孵育1 h，取样并于荧光镜下观察^［1-3］，从细胞形态学上识别凋亡细胞。

1.4统计学处理

采用SDAS，Sigma-plot统计程序检验数据。

2结果

2.1PR-3诱导人胎儿肾小球内皮细胞凋亡率：经PR-3处理的胎儿肾小球内皮细胞经DNA特异性染色，显示有明显的细胞凋亡，凋亡细胞特征为核染色体固缩、核碎裂和核酸片段形成(见图1a)。TNF-α处理组有类似现象，而PBS组凋亡不明显(见图1b)。且PR-3以剂量、时间依赖性形式引起内皮细胞发生凋亡。在剂量达10 μg/ml于24 h后凋亡细胞的百分率为(75.5±5.6)%；TNF-α处理组细胞凋亡率为(54.6±23.3)%；PBS处理组则为(1.8±1.2)%，PR-3处理组与PBS组比较差异具有显著性(P＜0.01)(见图2)。

图2aPR-3不同剂量处理6 h内皮细胞凋亡

呈剂量依赖性

图2bPR-3 (10 μg/ml) 24 h内皮细胞凋亡

呈时间依赖性

2.2核酸片段凝胶电泳观察凋亡梯形：经琼脂糖凝胶电泳分析提示，PR-3所引起的凋亡细胞其DNA片段约为220 bp的整倍数片段，于电泳条带上呈现出典型的凋亡梯形。TNF-α组有类似特征，而PBS组则无凋亡梯形出现(见图3)。

图3凋亡内皮细胞DNA电泳呈现凋亡梯形

2.3PR-3处理组胎肾内皮细胞光镜下细胞形态变化：分别于实验0、6、12、24 h在相差显微镜下对比观察各处理组细胞形态学变化，提示PR-3处理组于实验6 h，即有细胞与培养基分离脱壁、细胞裂解、悬浮而使折光度增强，随酶的剂量增加和时间的延长，这种形态学的变化趋于明显。而PBS组未见类似的变化。

3讨论

在ANCA相关性血管炎中，中性粒细胞可介导血管内皮细胞损伤^［1-3］。其一为ANCA可激活中性粒细胞，使其释放细胞质中的蛋白酶造成内皮损伤，另可介导自由基产生而损伤血管内皮^［1，5］。再者中性粒细胞胞浆中蛋白酶均具有直接的细胞毒性作用，可诱使多种细胞损伤、坏死或凋亡^{［1，2，6，7］}。在ANCA相关性肾小球肾炎病人，中性粒细胞胞浆蛋白酶-3可直接损伤肾血管内皮细胞而导致严重蛋白尿和进行性肾功能损害^{［1，3，8］}。本文采用ANCA阳性的SLE患儿外周血，分离纯化中性粒细胞胞浆蛋白酶PR-3，对培养人胎肾小球内皮细胞进行处理，发现PR-3对胎肾内皮细胞有直接的细胞毒性作用，可诱导肾小球内皮细胞发生凋亡^［1，9］，即：①用PR-3处理的内皮细胞DNA片段明显增加；②PR-3处理组内皮细胞死亡趋势与蛋白酶呈剂量和时间依赖性关系；③DNA特异性染色提示，PR-3处理组内皮细胞所含固缩染色体和碎裂核酸片段显著高于对照<