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Anti-inflammation effect of purified melittin on immune arthritis of rabbits
LI Yafei
（Department of Orthopaedics,Beijing Army General Hospital,Beijing 100700,China）
SHI Shushan,LI Xin,et al.
【Abstract】ObjectiveTo investigate whether the purified melittin has anti-inflammation effect on immuno-arthritis of rabbits.MethodsNatural rough melittin was purified by column chromatography to eliminate the hemolytic abilities.ResultsThe products were analyzde by fluorescense and circular dichroism spectrum and anti- inflammation effect of it on immune arthritis of rabbits were tested.ConclusionThe results showed that melittin possesses significant anti-inflammation effect on immune arthritis of rabbits and the hemolytic activity is greatly reduced.
【Key words】Melitten;Immunity;Osteoarthritis;Rabbits
类风湿关节炎是一种常见疾患，病因尚不清楚，治疗比较困难。本研究采用天然蜂毒，经柱层析获得纯化蜂毒肽，实验证实纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎具有显著抑制作用。
1材料与方法
1.1动物模型
1.1.1动物：成年新西兰兔20只，编号。
1.1.2免疫用完全性佐剂的制备：采用家兔卵蛋白性关节炎模型［1-4］。取羊毛脂5 ml＋液体石蜡10 ml(1∶2)，加温至70～80 ℃，磁力或震荡器混匀，成为不完全佐剂。取不完全佐剂4 ml加入旧结核菌素2 ml，50 U/ml，成为完全佐剂6 ml，磁力或震荡器混匀乳化，用前加入卵蛋白，成为3%卵蛋白溶液。
1.2致敏方法及分组
1.2.1首次刺激：在兔背部肩胛骨间选5个注射点，分别皮下注射完全佐剂0.5 ml致敏。
1.2.2再次刺激；致敏28 d后，于兔右膝关节内注入不完全佐剂1.0 ml。然后随机分为两组：A组(实验组)10只，B组(对照组)10只。分笼饲养，观察兔肢体活动情况，膝关节肿胀度(卡钳测其宽度，mm)，电子温度计测皮肤温度值(℃)。检查者不参加动物的分组和给药。统计学处理采用t检验。
1.2.3组织的处理：于50、80 d时各组处死5只取材，包括双侧膝关节、肌肉、关节囊、滑膜，以4%多聚甲醛固定，10% EDTA脱钙，切片，HE染色，光镜下进行组织学检查。
1.3纯化蜂毒肽的制备
粗提蜂毒适量溶于HoAc/NaAc缓冲液中，离心除去不溶性杂质，上清液经过Sephaden G-50F柱，流速5 ml/h，流动相为HoAc/NaAc缓冲液，收集流出液，再经Sephaden G-15柱脱盐后，冷冻干燥。干燥样品溶于HoAc/NaAc缓冲液，经过Sephaden G-50F，收集主峰位处流出液，经过Sephaden G-50F柱，脱盐后，冷冻干燥。
纯化物经高压液相色谱分析，显示单峰。又经CD光谱法和荧光光谱法，高压液相色谱分析氨基酸序列分析，显示提取物氨基酸序列与文献［3，4］报道蜂毒肽氨基酸序列一致。得蜂毒肽纯品。
1.4给药方法
纯化蜂毒以生理盐水溶解。在A组，于再次刺激后立即肌肉注射纯化蜂毒1 mg，1次/d，7 d后未见不良反应，改为2 mg，1次/d肌肉注射，14 d后改为3 mg，1次/d肌肉注射，直到处死。B组肌肉注射生理盐水。
1.5纯化蜂毒肽的溶血实验［2］
1.5.1红细胞悬液的配制：A组兔处死前，取新鲜静脉血10 ml，用竹签搅拌以除去纤维蛋白，再用生理盐水冲洗3～5次。每次加生理盐水5～10 ml，混匀后离心，弃上清液，再加入生理盐水，离心，直至上清液不呈红色为止。然后按所得红细胞的容积，用生理盐水配制成2%的悬液。
1.5.2溶血实验：纯化蜂毒肽以生理盐水配制成0.025%溶液。取试管7支，分别编号1～7号，每管各加入2%红细胞悬液2.5 ml。第1号管加入蜂毒肽溶液0.1 ml，生理盐水2.4 ml；2号管加入蜂毒肽溶液0.2 ml，生理盐水2.3 ml；3号管蜂毒肽溶液0.3 ml，生理盐水2.2 ml；4号管蜂毒肽溶液0.4 ml，生理盐水2.1 ml；5号管蜂毒肽溶液0.5 ml，生理盐水2.0 ml；第6号管加生理盐水2.5 ml作业空白对照；第7管不加供试品并用蒸馏水代替生理盐水，作为完全溶血对照。轻轻摇匀后置37 ℃的水浴中保温后观察结果，作出判断。
判定标准：①全溶血：溶液透明红色，管底无红细胞残留。②部分溶血：溶液透明，红色或棕色，底部尚有少量红细胞残留。镜检红细胞稀少或变性。③不溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色透明。镜检红细胞不黏集。
一般认为凡1 h后第3号管以及第3号以前的各管出现溶血、部分溶血或凝集反应即判定为有溶血作用。
1.6纯化蜂毒肽对家兔血红蛋白水平的影响
于注射纯化蜂毒肽14、28、50、80 d时，从兔耳静脉采血。二甲苯棉球涂擦兔耳，使血管扩张，针头刺破耳静脉，使血液自然流出，滴入已放有抗凝剂的试管。血样以自动生化分析仪检测血红蛋白水平，各种血细胞数量，检查结果进行t检验。
2结果
2.1大体观察：A、B两组兔再次接受刺激(关节内注射佐剂)后3～7 d，兔膝关节明显肿胀，宽度平均2.5 cm，行走时右后肢提起，不敢负重，皮温高，颜色发红。经用药后，A组兔活动逐渐恢复如常，右膝关节红、肿、热逐渐消退，组织无明显充血水肿现象。14 d时，关节宽度2.0 cm。第80天处死时，关节宽度1.8 cm(正常对照关节宽度平均为1.5 cm)。A组取材时发现，软组织水肿增厚不明显，肌肉色泽正常，关节腔内无积液。B组肌肉注射生理盐水，兔后肢活动持续受限，右膝关节红、组织肿胀现象消退不明显。14 d时，关节宽度2.4 cm。第80天处死时，关节宽度2.2 cm。不同时间点A、B两组间关节宽度的值差异有显著性，P＜0.05。B组取材时发现，软组织水肿，肌肉紫红，滑膜增厚，关节腔内有积液。
2.2组织学检查：A组，50 d时滑膜轻度增厚水肿，滑膜表面未见有纤维素被覆。80 d时滑膜下有散在炎细胞增生等反应，也以淋巴细胞、浆细胞为主，数量及密集程度明显较B组轻。滑膜内未见多核巨细胞，淋巴小结及大量新生血管。B组，50 d时滑膜充血、水肿、增厚变疏松，表面滑膜组织可见坏死灶有纤维素被覆。较多为淋巴细胞和浆细胞，少量中性白细胞渗出。80 d时即慢性滑膜炎期，滑膜内可见大量淋巴细胞和浆细胞浸润。浅层淋巴细胞浸润为弥漫性和局灶性且围绕小血管周围。可以见到淋巴小结，成为生发中心样。80 d时病变内浆细胞明显增多。滑膜增厚，慢性炎症改变，内层成垂直状排列，形成多核巨细胞。滑膜细胞达4层以上，新生毛细血管增生。
2.3纯化蜂毒肽溶血实验：保温1 h后第3号管以及第3号以前的各管未出现溶血、部分溶血或凝集反应。3 h第5号管部分凝集，镜检红细胞有黏集破坏现象。
2.4纯化蜂毒肽对家兔血红蛋白水平的影响：实验组兔注射纯化蜂毒肽14、28 d时，实验兔的血红蛋白水平略低于对照组，50、80 d各个时间点，实验组与对照家兔血红蛋白水平，各种血细胞数量差异均无显著性(P＞0.05)。
3讨论
本研究采用纯化蜂毒肽治疗家兔卵蛋白性关节炎。一般认为，家兔卵蛋白性关节炎模型在病程病理变化方面接近人类RA［1，2］。目前认为免疫变态反应是类风湿关节炎的发病基础，理由是许多患者血中都可检出类风湿因子(RF)，它是免疫球蛋白形成的免疫复合物，被白细胞吞噬后发生脱颗粒，释放水解酶，引起局部炎症反应［3-6］。免疫荧光法证明病变滑膜内有多种免疫复合物沉积。患部滑膜淋巴小结浆细胞能产生RF。随着炎症转为慢性，滑膜内T淋巴细胞和B淋巴细胞增多，形成多量浆细胞及免疫球蛋白。本实验可以见到B组淋巴小结变成为生发中心样，说明为免疫反应的表现。80 d时病变内浆细胞明显增多，有明显的慢性滑膜炎表现。一般认为这是产生类风湿因子的场所［7，8］。A组在完全佐剂再次刺激后也出现典型关节炎表现，但是经纯化蜂毒肽治疗后关节肿胀迅速减轻，组织学检查，滑膜只有轻度增厚水肿，滑膜表面未见组织坏死常有的纤维素被覆。滑膜下也只有散在局灶淋巴细胞浆细胞增生，数量及密集程度明显较B组轻。说明纯化蜂毒肽对滑膜炎起到了显著的抑制作用。
