【摘要】目的观察表皮生长因子(EGF)对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞的作用和细胞中有丝分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的激活情况。方法3～5代体外培养的RA滑膜细胞，³H-TdR掺入检测EGF对细胞DNA合成的影响；EGF刺激后裂解细胞，收获蛋白，Western blot检测MAPK的活化。结果EGF刺激组和对照组每分钟计数值差异有显著性(P＜0.001)。EGF能引起细胞内明显MAPK活化。结论MAPK可能是EGF刺激RA滑膜细胞增生的信号传导通路中的重要介质。

Effect of epidermal growth factor on rheumatoid synovial fibroblasts

YAN Taiqiang,LÜ Houshan,YAO Libo,et al.

^（Arthritis Research Center,People′s,Hospital,Beijing University,Beijiing 100044,China.）

【Abstract】ObjectiveTo determine whether EGF affects DNA synthesis and activates intracellular MAPK in rheumatoid synovial fibroblasts.MethodsCultured rheumatoid synovial fibroblasts were stimulated with exogenous EGF,then investigated³H-TdR incorporation;and Western blot analysis of cell lysates.ResultsThe incorporation of³H-TdR was significantly increased upon EGF treatment,meanwhile,immunoblotting revealed that MAPK phosphorylation was greatly increased.ConclusionMAPK is likely to recepter an important component in the cascade of signals that link EGF receptor to EGF eliciting the cellular proliferative response in rheumatoid synovial fibroblasts.

【Key words】Epidermal growth factor-urogastone;Arthritis,rheumatoid;Synovial membrane;Fibroblasts;Mitogen;Protein kinases

表皮生长因子(EGF)能刺激多种组织和细胞类型的分裂、增生或分化^［1］，在RA滑膜组织中EGF高表达^［2］。但是，有关EGF作用于RA滑膜细胞后，细胞中的信号传导途径以及相关信号传导分子的活性变化未见有报道。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂：DMEM培养基(Gibco公司产品)，EGF(300 μg/ml，北京经科生物制品公司)，³H-TdR(中国科学院原子能研究所)，去污剂蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)、ECL Western bolt发光试剂(Amersham公司产品)。

1.1.2抗体：三种抗活化型MAPK(ERK、JNK、p38)多克隆抗体(Promega，USA)、三种抗非活化型MAPK、CERK、JNK、p38)多克隆抗体(Promega，USA)、辣根过氧化物酶偶联驴或羊抗兔lgG。

1.2方法

1.2.1RA滑膜细胞的体外培养：20例RA病人均符合1987年美国风湿病协会(ARA)诊断标准^［3］。其中男4例，女16例，年龄平均46.5岁(20～75岁)，病程平均17.5年(3～47年)。滑膜切除5例，全膝关节置换15例。无菌获取滑膜组织，尽量剔除脂肪及纤维组织，PBS清洗两遍，剪成约1 mm³的碎块，置于无菌瓶内，用0.5 mg/ml的胶原酶Ⅰ消化4～5 h，200目纱网过滤后，离心2次，去除脂肪及杂质。加入DMEM培养液(含20%胎牛血清，20 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)，分装于培养瓶内，置于37 ℃、5%CO₂孵箱内培养24 h时后，弃除非贴壁细胞，更换培养液，待滑膜细胞基本长满后，消化传代，实验用3～5代细胞。

1.2.2³H-TdR掺入法检测RA滑膜细胞中DNA的合成：3～5代细胞以每孔1×10⁴种植于96孔板内。培养24 h后，更换无血清DMEM培养液静息24 h。然后换为实验培养液(对照及EGF 0.01～1 000 ng/ml 6个浓度梯度，各设4个复孔)，继续培养48 h。细胞收集前18 h加入37 kBq/L³H-TdR，培养结束后吸出孔内培养液，用PBS洗3遍，加入胰蛋白酶消化液终止。用多头细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，晾干后，将装有玻璃纤维滤膜的闪烁瓶中加入闪烁液，用1410液体闪烁计数器测定每份样品每分钟计数。

1.2.3EGF刺激RA滑膜细胞后蛋白的收集：直径为60 mm的培养皿中3～5代的滑膜细胞约90%长满时，吸除培养液，换用5 ml无血清DMEM培养液静息24 h，EGF(10 ng/ml)刺激滑膜细胞5 min后，预冷PBS冲洗3遍，加入单去污剂裂解液(50 mmol/L Tris*Cl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02%叠氮钠，100 μg/ml PMSF，5 μg/ml aprotinin，10 mmol/L矾酸钠，2 mmol/L EDTA，1% Triton X-100)100 μl，置于冰盒上20 min后，细胞刮仔细收集裂解的细胞，置于0.5 ml的EP管中，涡旋2次，置于冰盒中静止15 min，离心15 000 r/min，10 min，将上清移至新EP管中。

1.2.4蛋白浓度的测定：参照去污剂蛋白定量试剂盒的说明，首先绘制蛋白定量标准曲线。BSA(牛血清白蛋白)配成原液浓度为45 mg/ml，用裂解液依次稀释为0～1.5 mg/ml的浓度梯度。12.5 μl各浓度梯度标准液及10 μl待测蛋白溶液，依次加入A′液(A液＋S液)62.5 μl，混匀后加入500 μl B液，静止15 min后，于分光光度计750 nm下测定A值。待测蛋白通过其A值于标准曲线上定出蛋白浓度。

1.2.5Western blot分析：根据蛋白浓度，每条泳道上样25 μg蛋白，加入等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液(50 mmol/L Tris·Cl pH 6.8，100 mmol/L二硫苏糖醇，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油)，100 ℃加热5 min使样品中蛋白变性，30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜或室温下2 h，PBS-T(PBS＋0.1%Tween 20)洗膜15 min×1次，室温下摇床上一抗孵育2～3 h，PBS-T洗膜15 min×3次，二抗孵育1～1.5 h，PBS-T洗膜15 min×3次，于暗室中加入ECL发光试剂约1 min，X线片曝光，分析结果。

2结果

2.1³H-TdR掺入检测EGF对RA滑膜细胞DNA合成的影响：见图1。可以看出，EGF 0.01～10 ng/ml，随着剂量的增加，显著增加每分钟计数值，但剂量再增加100～1 000 ng/ml，每分钟计数值差异无显著性，采用两样本均数间配对t检验，EGF 1 ng/ml刺激组和对照组有差别，P＜0.05，EGF 10～1 000 ng/ml刺激组和对照组差异有显著性(P＜0.001)。

图1EGF对RA滑膜细胞DNA合成的影响

2.2蛋白定量测定：测定的A值与蛋白浓度成直线相关，直线方程为y＝2.77x－0.017，相关系数为0.994。说明该测定方法的可靠性。通过测定待测蛋白的A值，计算出其蛋白浓度。

2.3MAPK的检测：一抗为避免抗活化形式的多克隆抗体ERK(1∶20 000)、JNK(1∶5 000)、p38(1∶2 000)；二抗为辣根过氧化物酶偶联驴或羊抗兔IgG(1∶10 000)，结果表明ERK明显活化(图2)，JNK和P38均未见活化。

将上述硝酸纤维素滤膜用洗脱液(100 mmol/L β巯基乙醇，2%SDS，62.5 mmol/L Tris*Cl pH 6.8)洗脱抗活化形式ERK多克隆抗体；然后用抗非活化形式的ERK抗体(1∶100)进行检测，对照组和EGF刺激组蛋白条带ERK1和ERK2的信号强度几乎完全相同(图3)，表明本实验中检测到的ERK活性的变化并非由于ERK的表达量及上样量的差异所致。因两图是在同一张硝酸纤维素滤膜上用不同的抗体检测得出的，综合两图结果，证明滑膜细胞中ERK在EGF的作用下明显活化。

3讨论

RA对人类健康和生活质量造成极大的威胁。目前病因及发病机制尚不完全明确，除抗炎治疗外，缺乏特效药物控制关节早期病变；晚期需借助于人工关节来最大限度的恢复功能。因此，150多年来人们一直努力探讨RA的发病机制以早期控制病变。

图2活性型MAPK的检测

图3非活化MAPK的检测现在对于RA主要集中于滑膜细胞的类肿瘤性研究。人们注意到RA滑膜中存在过量的细胞因子、受体和与其有同源性的癌基因产物，它们可能作用于滑膜细胞信号传导途径的不同部位，导致持续的信号传导，从而引起RA滑膜细胞的无限制增生^［4］。

EGF是1959年在神经生长因子的研究过程中偶然发现的。由53个氨基酸组成，分子量为6 000，是强有力的促细胞分裂因子，能刺激体内或体外培养的多种组织和细胞的分裂、增生、分化^［1］。EGF与RA的发病密切相关，Shiozawa等^［2］1989年用免疫组织化学的方法证明RA滑膜衬里层细胞EGF及受体的表达量同衬里层的厚度及新生血管的程度成正比，明显高于骨关节炎(osteoarthritis，OA)及创伤性关节炎。RA的关节液及滑膜组织中EGF的含量高于OA^［5］。我们在本实验中首次应用体外培养RA滑膜细胞，加入外源性EGF刺激，观察对细胞增生的影响，实验结果表明，EGF能显著诱导细胞的增生。从而证明了EGF<