【摘要】目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者B、T淋巴细胞对SLE及正常人骨髓粒巨噬细胞集落形成单位(GM-CFU)的影响。方法分别用SLE患者及正常人B、T及B＋T淋巴细胞加入半固体甲基纤维素培养体系中，观察它们分别对16例SLE患者及12名正常人GM-CFU产率的影响。结果加入SLE患者B、T淋巴细胞后，分别可见75.0%和37.5%的SLE患者GM-CFU形成减少，产率为(109±71)个/10⁵细胞和(137±34)个/10⁵细胞，与未加淋巴细胞组比较差异均有显著性(P＜0.01，P＜0.05)，同时加入SLE患者B和T淋巴细胞时87.5%的SLE患者GM-CFU产率减少，为(98±31)个/10⁵细胞，与分别加入SLE患者B或T淋巴细胞组比较均有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)；SLE患者B及B＋T淋巴细胞分别对58.4%、66.7%的正常人骨髓GM-CFU形成有抑制作用，产率为(203±67)、(199±92)个/10⁵细胞，明显低于未加淋巴细胞组(P均＜0.01)，而正常人淋巴细胞对SLE患者GM-CFU的产率与未加淋巴细胞组比较差异无显著性(P均＞0.01)。结论SLE患者B淋巴细胞无论对大部分SLE患者或大部分正常人骨髓GM-CFU的形成有抑制作用，SLE患者的B＋T淋巴细胞对SLE患者和正常人骨髓GM-CFU的抑制有协同作用，SLE患者的B淋巴细胞的异常可能是SLE粒细胞减少的主要原因，而其造血干/祖细胞的异常可能也是粒细胞减少的原因之一。

Lymphocyte depression to systemic lupus erythematosus patient′s granulocyte-macrophage colony forming unit

LI Juan,YIN Peida,LUO Shaokai,et al.

Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Science,Guangzhou 510080,China

【Abstract】ObjectiveTo research the influence of B-lymphocytes,T-lymphocytes on systemic lupus erythematosus (SLE) patient′s and control′s granulocyte-macrophage colony forming unit (GM-CFU).MethodsGM-CFU of 16 active SLE patients and 12 controls was cultured and observed in vitro in semisolid methylcellulose with B-lymphocytes and T-lymphocytes respectively and together.ResultDecreasing of GM-CFU appeared in 75.0% or 37.5% of SLE patients after SLE B-lymphocytes or T-lymphocytes added to culture system.The products were (109±71) colonies/10⁵ cells and (137±34) colonies/10⁵ cells respectively,differed from nonlymphocyte SLE patient′s ones (P＜0.01，P＜0.05).The product which was (98±31) colonies/10⁵ cells in 87.5% of patients in culture system adding with B-and T-lymphocytes was lower than B- or T-lymphocytes groups (P＜0.05，P＜0.01).Reduction of GM-CFU appeared in 58.4% and 66.7% of controls with B-lymphocyte and B-lymphocyte ＋ T-lymphocyte in SLE,respectively.The puoducts were (203±67) colonies/10⁵ cells and (199±92) colonies/10⁵ cells which were all lower than nonlymphocyte one (P＜0.01).The products of SLE patients cultured with controls lymphocyte had not different from nonlymphocyte ones (P＞0.01).ConclusionSLE patient′s B-lymphocyte may restrain GM-CFU of not only most control′s but also most SLE patient′s.B- and T-lymphocyte in SLE have the effect of cooperation with restraining the products of GM-CFU of SLE patients or controls.Abnormality of B-lymphocyte in SLE plays a main role in leukopenia.Abnormality of hematopoietic stem cell may be also one cause of leukopenia.

【Key words】Lupus erythematosus,systemic;Lymphocytes;Granulocyte-macrophage colony forming unit

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的临床表现复杂，70%的SLE患者可伴有血液系统的损害，表现为贫血和/或白细胞减少和/或血小板减少，白细胞减少的原因以往一直被认为是SLE患者血浆中存在自身抗体所致。本研究分别用SLE病人及正常人B、T淋巴细胞加入粒巨噬细胞集落形成单位(granulocyte-macrophage colony forming unit，GM-CFU)半固体甲基纤维素中，观察淋巴细胞对SLE患者骨髓GM-CFU形成的影响，通过集落生长情况探讨SLE患者淋巴细胞对粒巨噬系造血功能的抑制活性作用及其SLE患者白细胞减少原因。

1资料与方法

1.1病例来源：选择16例处于活动期的SLE患者，所有病例诊断符合1982年美国SLE诊断标准，其活动性采用Bombardie等^［1］提出的标准。其中男性3例，女性13例，平均年龄18～49.5岁，中位年龄33.5岁，16例SLE患者外周血象：红细胞(310～380)×10¹²/L，血红蛋白79～98 g/L，白细胞(3.0～3.5)×10⁹/L，淋巴细胞绝对值(0.5～1.0)×10⁹/L，血小板(700～990)×10⁹/L。

1.2标本采集：所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，抽出骨髓10 ml，用Ficoll液离心，取出粒系祖细胞，RPMI-1640洗3次，调整细胞数为2×10⁶/ml。正常12名对照标本取自异基因骨髓移植供体的骨髓细胞，RPMI-1640洗3次，调整细胞数如上。

1.3外周血淋巴细胞的提取：按常规方法进行。B淋巴细胞的提取：取上述SLE患者及正常对照的肝素抗凝外周血10 ml，经过淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，加1.5 ml冷的培养液于尼龙棉柱中，收集液经离心去上清液，计数并制成细胞浓度为2×10⁵/ml的B淋巴细胞悬液。T淋巴细胞的提取：经上述制备的单个核细胞，加10%的小牛血清，置培养皿中孵育30 min，收获贴壁细胞，与处理过的绵羊红细胞混合，1 h后用淋巴细胞分离液分层，沉淀部分用RPMI-1640洗5次后，制备成2×10⁵/ml的T淋巴细胞悬液。

1.4粒系祖细胞集落培养及鉴定：骨髓GM-CFU培养按常规的方法进行，GM-CFU培养体系主要包括终浓度为30%的胎牛血清(FCS)，10%的GM-CSF，0.9%的甲基纤维素，粒系祖细胞浓度为2×10⁵/ml。此外，含少许谷胺酰胺、2-巯基乙醇、双抗(青霉素和链霉素)。实验组加入2×10⁴/ml的B或T或B、T各半的细胞。培养条件：37 ℃，5% CO₂，100%湿度，培养7 d后计数，细胞数≥40个为一集落，3～39个为一丛落，集落或从落单位为个/10⁵细胞。GM-CFU的形态学观察及组织化学分析：用自制的毛细吸管吸出集落细胞于经粘胶处理过的载玻片上，干燥后甲醇固定30 min，瑞氏染色，油镜下可见集落由中性中幼粒细胞、中性杆状核细胞、中性分叶核细胞及少数单核巨噬细胞组成，过氧化酶(POX)染色98%的细胞呈阳性反应。

1.5抑制率计算及统计学处理：抑制率＝(对照组－实验组)/对照组×100%，均数之间比较用t检验，两率之间比较用χ²检验。

2结果

2.1SLE患者与正常人骨髓GM-CFU生长情况比较

SLE患者骨髓GM-CFU集落数(182±50)个/10⁵细胞、丛落数(231±92)个/10⁵细胞，正常对照骨髓GM-CFU集落数为(256±80)个/10⁵细胞、丛落数为(106±42)个/10⁵细胞，SLE患者与正常骨髓集落、丛落分别比较差异均有显著性(P＜0.001，P＜0.01)。

2.2SLE患者、正常人淋巴细胞分别对SLE患者和正常人骨髓GM-CFU形成的影响

2.2.1SLE淋巴细胞对SLE患者骨髓GM-CFU形成的影响：在培养体系中，加入2×10⁴/ml的SLE患者的B淋巴细胞后，12例(12/16，占75.0%)SLE患者的GM-CFU形成明显减少，产率为(109±71)个/10⁵细胞，与未加淋巴细胞组比较P＜0.01，抑制率为39.8%，另4例GM-CFU的产率为(189±19)个/10⁵细胞，与未加淋巴细胞组SLE骨髓GM-CFU集落比较，差异无显著性(P＞0.05)，但低于正常人骨髓GM-CFU集落的产率(P＜0.001)。单独加入SLE患者的T淋巴细胞时，仅有6例(6/16，占37.5%)，SLE患者的GM-CFU产率下降，为(137±34)个/10⁵细胞，与加B淋巴细胞组及未加淋巴细胞的SLE患者的GM-CFU差异均有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，抑制率为24.7%，余10例CFU-GM的产率不减少，为(190±46)个/10⁵细胞。如果同时加入SLE患者的B、T淋巴细胞14例(14/16，占87.5%)SLE患者的GM-CFU产率减少，为(98±31)个/10⁵细胞，与分别加入B或T淋巴细胞组均有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)，抑制率为46.0%，余2例GM-CFU产率为(180±39)个/10⁵细胞，与未加淋巴细胞组SLE骨髓GM-CFU集落比较差异无显著性(P＞0.05)，但低于正常人骨髓GM-CFU的集落产率(P＜0.001)。

2.2.2SLE患者淋巴细胞对正常人骨髓GM-CFU形成的影响：在正常人GM-CFU培养体系中，加入2×10⁴/ml的SLE患者的B淋巴细胞，7例(7/12，占58.4%)正常人骨髓的GM-CFU形成减少，产率为(203±67)个/10⁵细胞，与未加淋巴细胞组比较P＜0.01，抑制率为20.7%，与SLE的B淋巴细胞对SLE患者骨髓GM-CFU抑制率比较差异有显著性，P＜0.05；单独加入SLE患者的T淋巴细胞时，仅有1名(1/12，占8.3%)正常人骨髓的CFU-GM产率下降，为219.5，与未加淋巴细胞的正常人骨髓的GM-CFU差异有显著性(P＜0.05)，余11例GM-CFU的产率不减少，为<