第二军医大学学报2000年第21卷第4期

邓安梅仲人前陈孙孝施笑梅孔宪涛

摘要目的:利用重组抗原检测自身免疫疾病患者血清中抗SSB自身抗体并探讨其临床意义。方法:应用DNA重组技术构建SSB基因工程菌,并表达SSB融合蛋白。经GST柱层析法纯化后,分别经蛋白质印迹（WBT）法和酶联免疫吸附（ELISA）法检测20份干燥综合征患者、60份系统性红斑狼疮患者和30份正常人血清。结果:经常规试剂盒检测为SSB（+）的24份患者血清，利用重组抗原检测均阳性；经常规试剂盒检测为SSB（-）的56份患者血清，利用重组抗原检测有11份阳性（WBT法4份，ELISA法7份）。结论:利用重组抗原检测抗SSB自身抗体敏感性较高。利用重组抗原对自身抗体进行定性、定量分析有助于对自身免疫疾病的诊断。

关键词：自身抗原，SSB；自身免疫疾病；蛋白质印迹法；酶联免疫吸附法

在自身免疫病的发病机制中，自身抗原和抗体的反应起着重要的作用。在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)中，SSB是重要的自身抗原^［1］,抗SSB抗体的检测是诊断SLE,SS的重要的实验室检查指标之一。传统上检测抗SSB抗体多用从动物组织中提取的SSB,其制备较为复杂,难以对检测结果进行质量控制,也难以对自身抗原-抗体之间的分子作用作进一步研究^［2］。因此,我们尝试用重组抗原检测抗SSB自身抗体,以利于疾病的早期诊断。

1材料和方法

1.1材料人肝λgt11 cDNA 文库（Dr.R.Davis赠送）；pGEX-2T质粒和JM109菌株均为本实验室保存；Taq DNA多聚酶，EcoRⅠ内切酶，BamH Ⅰ内切酶，T4 DNA连接酶均购自Promega公司。常规检查采用德国欧蒙公司的间接免疫荧光试剂盒及国产ENA（可溶性可抽提核抗原）检测试剂盒（恒佳生物技术公司）。

1.2血清标准抗SSB阳性血清由美国疾病控制中心（CDC）提供。患者血清来自本院1994年8月至1997年8月收治的住院患者，其中SLE60例、SS 20例。所有患者均符合美国风湿学会制定的诊断标准^［3,4］。30份正常对照血清取自献血员。

1.3SSB的基因克隆与序列测定以标准抗SSB血清为免疫探针，筛选人肝λgt11 cDNA文库,挑取表达SSB的阳性克隆。对阳性克隆中含有的cDNA片段进行DNA测序鉴定，参考文献［5］的方法进行。

1.4表达型SSB重组菌的构建自行设计用于特异性扩增SSB cDNA的一对引物。3′端引物:5′GGCGAATCCCTGGTCTCCGGCACCATT3′；5′端引物:5′AAGGGATCCTACCGACTTTTACCACTA3′。PCR反应体系及扩增条件参见文献［6］。将经过DNA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切后，定向插入pGEX-2T，转导入宿主菌JM109。经双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。

1.5SSB重组融合蛋白在大肠杆菌的表达、鉴定与纯化挑取经鉴定后的重组克隆于LB/Amp培养液、37℃培养至光密度（D）值为0.6,以IPTG诱导表达3 h。收集菌液，经超声破碎,用含8 mol/L尿素的裂解缓冲液溶解包含体，而后加入900μl氧化还原缓冲液进行复性。将样本液反复流经GST亲和层析柱，再用含5 mmol/L还原型谷胱甘肽的PBS溶液洗脱柱上的融合蛋白,收集洗脱液,进行10%SDS-PAGE电泳，用蛋白质印迹（WBT）法分析重组融合蛋白的抗原特异性。

1.6利用重组融合抗原对自身抗体的检测

1.6.1WBT法重组蛋白经电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的PBS(pH7.4)封闭1 h；而后依次加入抗SSB标准血清、 HRP标记兔抗人IgG抗体，加入3，3-二氨联苯胺溶液和30%H₂O₂。

1.6.2ELISA法重组融合抗原用包被缓冲液CBS(碳酸氢钠缓冲液pH9.5)调节至4 μg/ml,4℃过夜(16 h)。而后依次加入被检血清、HRP标记兔抗人IgG抗体，加显色剂3,3-二氨基联苯胺和H₂O₂,3～5 min后加入0.1 ml 2 mol/L硫酸终止反应,经酶比色仪450 nm比色。设相应的血清稀释液抗原抗体反应产物在450 nm时产生的1个D数字为1个抗体单位（U）。

2结果

2.1重组质粒的构建与鉴定经EcoRⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可见SSB重组质粒释放出约1.6 kb的片段（图1）。测序结果表明,重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1296个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。

2.2SSB重组融合蛋白的表达、纯化经琼脂糖凝胶电泳显示，大约在1.2 kb处可见清晰的特异性扩增条带。DNA测序表明它是SSB基因的精确拷贝。用双酶切法证实质粒载体中含有以正确方向插入、符合预期长度的目的基因(图2)。

图 1经EcoRⅠ酶切后的SSB重组质粒电泳图

fig 1The SSB recombinant plasmid after

digestion of EcoRⅠ enzyme

1:SSB recombinant plasmid;2:SSA-60 recombinant plasmid;

3:DNA M_r marker

图 2SSB-pGEX-2T重组子电泳图

fig 2The SSB-pGEX-2T plasmid after

digestion of EcoRⅠ and BamHⅠ enzyme

1： SSB recombinant plasmid;2： The PCR product of SSB;

3： DNA M_r marker

经IPTG诱导表达的大肠杆菌菌液经10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，在相对分子质量约73000处有一浓染蛋白条带，而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。经GST层析柱纯化后,获得纯化的融合蛋白(图3)。

图 3重组融合蛋白电泳图

fig 3The SDS-PAGE of SSB-GST fusion protein

1:The lysis of E.coli JM109 containing pGEX-2T plasmid;

2:Protein M_r marker; 3:The lysis of E.coli JM109

containing SSB-pGEX-2T plasmid;

4:Purified SSB-GST fusion protein

2.3重组融合抗原检测抗血清不同标准抗血清WBT反应证明,重组抗原能与标准抗SSB血清反应，与其他抗血清无交叉反应(图4)。

图 4SSB重组融合抗原的免疫印迹

fig 4Immunoblotting of SSB fusion protein

1:Standard anti-U1 RNP serum；2:Standard anti-SSA-60 serum；

3:Standard anti-SSA-52 serum；4:Standard anti-SSB serum

在ELISA法检测时，正常对照组值为（76±40） u,因此以大于276 U(±5s)为阳性标准,小于276 u为阴性标准。结果显示，经常规试剂盒检测为SSB（+）的24份血清,用重组抗原WBT法或ELISA法检测均阳性。经常规试剂盒检测为SSB（-）的56份血清中，用重组抗原经WBT法检测有4份血清为SSB（+），而ELISA法检测有7份血清阳性。在ELISA法检测中，分别加入标准抗SSA-60、抗SSA-52、抗Sm、抗U1 rNP血清，反应均为阴性，表明此重组抗原ELISA法检测抗SSB抗体具有特异性。本研究将同一份血清标本检测10次，所得结果的CV值为10.7%；将同一份血清分装冻存标本在3个月内检测10次，所得结果的CV值为12.4%，表明本研究建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。

3讨论

本研究采用标准抗SSB血清筛选人肝λgt11噬菌体cDNA文库，对所得阳性克隆的DNA序列进行了测定，结果表明重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1 510个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。含重组质粒的大肠杆菌JM109经IPTG诱导，其裂解液经SDS-PAGE电泳在近73000处出现大量蛋白表达，不含目的基因的大肠杆菌JM109在相应的位置未有浓蛋白条带，而含空载体pGEX-2T的大肠杆菌JM109经IPTG诱导后也出现大量蛋白表达，但位置在26000处，这与载体表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。根据氨基酸组成推算，SSB重组蛋白的相对分子质量为47000,再加上载体pGEX-2T本身可表达的原核多肽谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为26000,融合蛋白相对分子质量预计在73 000左右，我们的结果与之相符。

在本研究的初期，我们收集少量重组菌液并用煮沸法得到的上清，经鉴定具有较好的抗原性。但这种方法不宜用在大量提取和进一步提纯单一蛋白质上。由于超声破碎法具有简便易行的优点，因而我们采取<