关键词: 输血传播病毒；肝组织；原位杂交

【摘要】目的探讨输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)在人肝组织中的分布状况及其意义。方法采用地高辛标记探针，对肝组织中的TTV基因进行原位杂交定位检测。结果原位杂交染色阳性者为细胞核团块状。5例正常人中有1例阳性，5例乙型肝炎患者有3例阳性，4例丙型肝炎患者有2例阳性，3例戊型肝炎患者有1例阳性。结论TTV可感染肝细胞并在肝细胞核内复制。正常人及不同型肝炎病人的肝细胞内均可感染TTV。

Detection of TTV DNA in liver tissue by in situ hybridization

LI Boan,CHENG Yun,WANG Liping, et al.

Department of Immunology,302 Hospital of PLA,Beijing 100039

【Abstract】ObjectiveTo probe the distribution of transfusion transmitted virus (TTV) in liver tissiue.Methods TTV gene was detected in liver tissiue by situ-hybridization using digoxiginin-labeled probes.Results TTV genes detection by in situ-hybridization are massing in nucleoli of liver cells. It was detected in liver tissiue from 1 of 5 healthy individuals, 3 out of 5 patients with hepatitis B, 2 out of 4 patients with hepatitis C, 1 out of 3 patients with hepatitis E.Conclusion The data suggested that TTV infection is existed in general population and in patients with different types of hepatitis. The virus can replicate in nucleolus of liver cells.

【Key words】TTVLiver tissiuesIn situ hybrdization

除甲～庚型肝炎病毒^［1］外，仍有3.5%～15.0%的肝炎病人无法进行病原学分型。1997年12月Nishizawa等^［2］首次从1例不明原因的输血后肝炎病人血清中分离到1种新的肝炎相关病毒基因，被暂命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)。我们采用巢式聚合酶链反应(PCR)对北京地区的正常人群和各型肝炎病人进行了TTV DNA检测，并对其中1株TTV PCR产物进行了序列测定，其与日本报道的TTV的同源性为96.0%，证明为TTV。尔后我们采用原位杂交技术对正常人群和各型肝炎病人的肝组织中TTV DNA进行了检测，以探讨其在肝组织中的分布状况及意义。

材料与方法

一、病例选择及临床资料：随机选取北京第302医院1995～1996年进行肝脏穿刺取活检标本的17例病人，其中男性11例，女性6例，年龄18～63岁，平均为37岁。诊断标准采用第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订标准(北京)，其中乙型肝炎5例，丙型肝炎4例，戊型肝炎3例。5例的正常肝组织取自尸检标本，其中交通意外死亡4例，溺水死亡1例。肝活检组织标本用10%福尔马林固定后，常规石蜡包埋。

二、探针制备：根据Okamoto等^［3］报道的TTV基因序列设计引物，应用PCR技术由TTV感染患者血清中分离TTV部分基因片段，并经核苷酸序列测定与日本株同源性为96.0%，再用地高辛试剂盒(购自德国Boehringger Mannheim公司)按说明书标记探针。

三、原位杂交：石蜡切片经68℃烘烤3小时，二甲苯、乙醇梯度至0.1%DEPC液，依次加入PBS-Mg^、0.2%甘氨酸、2×SSC EDTA、0.4%Triton X-100，各放置10分钟，3μg/ml蛋白酶K 37℃消化30分钟，浸入4%多聚甲醛10分钟，2×SSC平衡并热变性切片后加预杂交液(10%葡聚糖硫酸脂，50%去离子甲酰胺，500μg/ml变性鲑精DNA，1×Denhardt's，2×SSC，0.1%SDS)，置37℃ 2小时，滴加经热变性探针1μg/ml，42℃杂交20小时。经梯度SSC洗涤，滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶800)，置37℃ 1小时，用PBS缓冲液洗涤后加硝基四氮唑烂(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(PCIP)，置室温暗室1小时，用PBS缓冲液洗涤终止显色，然后用甘油封片。阴性对照为杂交液，不加探针。

四、结果判定：以肝组织切片中出现特异性蓝紫色产物为标准，定位TTV基因。

结果

阳性杂交信号呈蓝紫色团块状或颗粒状，集中于肝细胞核内，在整个肝组织中均匀分布。阴性对照中未见蓝紫色产物。17份标本中共有7份呈阳性，阳性分布情况为：正常人检测5例中，1例TTV阳性；5例乙型肝炎患者中，3例TTV阳性；4例丙型肝炎患者中，2例TTV阳性；3例戊型肝炎患者中，1例TTV阳性。

讨论

TTV病毒是由Nishizawa等^［2］应用代表性分析法(representational difference analysis,RDA)发现的。该病毒为单链DNA病毒，无包膜，病毒基因组全长3 739个核苷酸，有两个开放读码框ORF1和ORF2。目前，尚未确定TTV属于哪一科病毒，但它具有微小DNA病毒科的某些特征。Okamoto等^［3］对日本各型肝病患者、暴露于血液或血制品的高危人群及供血员的血清检测，结果发现各型肝病患者的TTV DNA检出率均高于供血员；在肝脏组织中的TTV DNA 滴度较血清中高10～100倍。受血者感染TTV后，表现为一过性或持续性病毒血症，并与ALT异常有关。但由于样本较小，TTV与肝功能损害的关系尚待进一步研究。该病毒也可经粪口途径传播^［4］。

本研究用于标记探针的TTV DNA片段位于病毒基因组的ORF1区，探针DNA经序列测定，与日本TTV核苷酸序列同源性为96.0%，并用BLAST程序检索了GenBank＋EMBL＋PBD序列库，除与日本报道的TTV DNA有很高的同源性外，未发现与其他病毒的基因序列有高度的同源性。原位杂交结果显示，TTV在肝细胞内复制，且集中在宿主的细胞核内，说明TTV可能为核内寄生或其基因已整合至细胞基因组中。感染TTV的宿主细胞未见明显的坏死倾向，提示该病毒可能比较温和。被TTV感染的细胞核浆比高于未感染的细胞，提示该病毒感染可能与细胞所处的繁殖周期的不同时期有关。由于TTV基因组较小，全长仅有3 000个核苷酸，因此，其复制可能要依赖于宿主细胞的某些功能。

本研究结果表明，各型肝炎病人的TTV感染率(6/12)高于正常人群(1/5)，这与TTV感染的血清流行病学调查结果一致^［4］。在其他组织中是否存在TTV感染，是否有TTV健康携带者，以及TTV感染的临床意义等问题有待进一步的研究。

本文经庄辉教授修改，特此致谢

参考文献

1Linnen J,Wages J Jr,Zhang-Keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent.Science,1996,271∶505-508.

2Nishizawa T, Okamoto H,Konoishi K,et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttranfusion hepatitis of unknowon etiology.Biochem Biophys Res Commun,1997,241∶92-97.

3Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis os unknown etiology.Hepatol Res,1998,10∶1-16.

4骆抗先，章廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的流行病学、临床、病理和病毒学的初步研究.第一军医大学学报，1998，18∶87-90.

收稿：1999-04-15

修回：1999-05-10