根据肾综合征出血热病毒(HFRSV)抗原检测、分型和流行病学目前还存在许多待解决的问题，研制了HFRSV的核衣壳基因工程抗原，建立了逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(RT-PCR-RFLP)分型方法。

根据HFRSV汉滩型(HTN)代表株76-118S片段cDNA序列，用引物1(5'-atg cat gcg gcc gct ca act atg gag g-3')与引物2(5'-gat tt aga tct aga gtt tca aag gct c-3')扩增了全长S基因片段；引物1与引物3(5'-t tc ttc tgc ctt cat gct-3')扩增了S基因N端的部分片段，并将它们克隆至强启动子T7表达载体pTSAPA和pEt-28a中，分别进行融合表达和非融合表达。对诱导表达产物进行SDS-PAGE分析显示，全长S基因片段及部分S基因片段均获非融合表达和融合表达，非融合表达产量分别约为9%和13%，分子量分别约为50×10³和22×10³，融合表达产量分别约为16%和20%，分子量分别约为64×10³和37×10³。Western blot结果显示，两种非融合表达产物均能与6份患者血清及抗衣壳蛋白单克隆抗体5H5反应，表明表达产物具有生物活性；融合表达产物不与上述抗体反应，表明其缺乏生物活性。以非融合表达的两个S基因片段产物作为间接ELISA的包被抗原，其工作浓度均高达1∶10 000，有望替代天然抗原用于HFRSV抗原、抗体检测。研究中还对全长S基因表达产物(50×10³分子量)和N端部分S基因(37～612，22×10³分子量)表达产物的生物活性进行了比较，二者无明显的差异。S基因表达产物为线性抗原，其抗原决定簇主要集中于N端，所以22×10³小分子量抗原可以替代完整S片段抗原。22×10³小分子量抗原，表达量相对较高，更适于抗原的制备。

根据HTNV76-118株及汉城型(SEOV)R22株M片段cDNA序列，选取同源性较高的G1区设计引物4(5'-gca tca gtg aag cct ttt c-3')，引物5(5'-gca gat gtg ccc aac cat g-3')，建立了RT-PCR，检测我国不同地区由8种主要宿主分离的37份HFRSV毒株，2份阳性标准对照毒株和5份阴性对照标本。RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，显示39份毒株标本中，36株(含HTNV76-118株和SEOV R22株)扩增出299bp的目的DNA条带，余3株标本(A1018、HU、B9)未见特异性扩增条带。5份阴性对照标本在任何反应条件下均无可见的扩增条带。将此结果与cELISA法比较，二者阳性检出率分别为100%和84.6%，符合率为84.6%，但前者比后者敏感性高15.4%，其特异性已被核酸探针杂交试验证实，实验操作也较简便，同时还可进一步对待检毒株分型。因此，RT-PCR法比cELISA更适用于分子流行病学调查。

在20个毒株的型特异性基因所在的M片段G1区选择扩增片段，在扩增片段中选择两种酶切位点进行二级酶切建立了RT-PCR-RFLP分型法。一级酶切用RsaⅠ将毒株分为HTN型、SEO型和未定型；二级酶切用HindⅢ从未定型毒株中分出部分HTN型。结果被定为HTN型的9株(76-118、C4、LR1、A9、A537、Chen、A16、H5、B5)，SEO型的8株(R2、R27、L99、S45、HR54、R22、Hubei、HB55)，余3株(R178、鲁胎、鲁姚)未能定型。该法流程简单，分型率较高，结果也比较可靠。RT-PCR-RFLP分型法与血清学分型法所得结果具有很高的符合率，但RFLP法的分型率为85%(17/20)，血清法的分型率为55%(11/20)，前者比后者高30%。鉴于RFLP法分型率高，操作简便，所以有较好的应用前景。

(收稿：1999-02-25)