关键词: 麻疹病毒；RT-PCR；序列分析

摘要本文报道以反转录二步多聚酶链反应方法(RT-PCR)直接测定麻疹病人唾液、尿液标本中的麻疹病毒(MV)血凝基因(H)、核衣壳基因(N)。以RT-PCR产物纯化后进行MV 450nt H、282nt N基因核苷酸片段测序分析，测序结果一致表明，1995～1997年期间中国部分地区MV流行株存在两种基因型。其中一种基因型只发现1株，与EDw54株相同，另一种基因型占流行株的绝大多数(称新基因型)，与其它国家以前报道的MV流行株基因型的N基因最大差异为15.4%与EDw54、疫苗株相差8.8%；H基因最大差异是10.8%。

Geneotic Analysis of Wild Type Measles Viruses Circulating in China During 1995-1997 Sun Yingjie^*， Li Jin, Ge Li. ^*Liaoning Provincial Anti-Epidemic and Health Station Shenyang,China 110005

AbstractTo investigate the molecular epidemiology of measles virus (MV) in China, sequence analysis of MV was performed based on a 282-nt region of the nucleoprotein (N) gene and a 450-nt region of heamaglutinin (H) gene by direct sequencing of RT-PCR amplicons obtained from clinical specimens. Results revealed that one MV strain belonged to ED-like genotype and remainder strains were clustered into a new genotype which was distinct from Chinese vaccine strains and MV strains circulating in other countries, as previously described representing a new genotype. There was up to 15.4% divergence in the nt-282 N gene and 10.8% divergence in the nt-450 H gene between the new genotype and other genotypes.

Key wordsMeasles virusRT-PCRSequence analysis

麻疹病毒自1954年首次分离成功后(Edmoston-54株，简称EDw54)，40多年来一直认为MV为单一血清型，但是近年来随着分子生物学技术的发展，对MV-RNA的研究有所进展。目前，美国、英国等国家已发现MV流行株有不同的基因型^［1～6］，特别是Rota PA(1995)^［3］报道了美国及世界各国1988～1995年期间MV基因型有6种；Jin L(1997)^［5］报道了英国1992～1995年期间MV流行株基因型有3种。为了解中国MV流行株基因型，1995～1997年期间我们采集辽宁省7个市及来自河南、河北两省的麻疹病人急性期的唾液、尿液标本以RT-PCR方法直接测定MV-RNA。PCR产物纯化后进行MV-H、N基因核苷酸片段测序分析，基因分型。

材料和方法

一、标本：1995～1997年期间采集辽宁省盘锦、沈阳等7个市及来自河南(郑州)、河北(石家庄)的麻疹病人急性期的唾液46份、尿液32份、血清46份。标本采集后置－20℃保存备用，血清用于抗MV-IgM检测，尿液和唾液用于MV-RNA检测。

二、抗MV-IgM测定：使用中国药品生物制品检定所生产的抗MV-IgM ELISA试剂盒，具体方法按说明进行。

三、RT-PCR引物：研究所用MV-H、N基因引物均由Central Public Health Labolatory UK(CPHL.UK)提供，其结构如下：H1(＋7844) 5′ACATCAATCAGAGGTCAATTC3′，H2R(－8414) 5′AGCATGTCTCCATTCGCAACT3′，H3(＋7852) 5′CAGAGGTCAATTCTCAAACA3′，H4R(－8404)5′CATTCGCAACTTGTCATCTG3′；N1(＋1304－1323) 5′TGCATACTACTGAGGACAA3′，N2R(－1694－1674) 5′TCTCGCACCTAGTCTAGAA3′，N3(＋1324－1341) 5′ATCAGTAGAGCGGTTGGA3′，N4R(－1641－1624) 5′GTCTGAGCCTTGTTCTTC3′。

四、参考病毒株：EDw54野毒株，Mor(为国外疫苗株)，Chang China57、94为辽宁现用长春麻疹疫苗毒株。上述病毒基因序列来自基因库，其他国家的MV流行株基因序列有的来自基因库，有的来自CPHL.UK。

五、MV-RNA提取方法：采用Boom等(1990)报道的硫氰酸胍-石英硅粉方法^［7］。

cDNA合成、RT-PCR二步法、MV-H、N基因核苷酸片段序列测定、核苷酸序列分析方法均按Jin L使用的方法(1997、1996)^［5，8］。

结果

一、抗MV-IgM ELISA结果：46例疑似麻疹病人中，37例抗MV-IgM ELISA阳性，8例阴性，1份未检测。8份抗MV-IgM阴性中有3份RT-PCR MV-RNA阳性，此3例可能由于采血时间距发病时间很短的原因，所以抗MV-IgM ELISA阴性。

二、MV-H、N基因核苷酸片段RT-PCR结果：采集的46份唾液，MV-H、N基因RT-PCR 31份阳性；32份尿液19份阳性。MV-H、N基因PCR产物分别是552bp，317bp大小核苷酸片段。

三、MV-N基因核苷酸片段测序分析结果：1995～1997年期间的MV流行株按年份、地区、流行特征选10株N基因测序分析(282nt nt1235-1516)。结果：SY2 China97株(发病前、后未注射麻疹减毒活疫苗)与EDw54野毒株完全相同，与疫苗株(Chang China57、94)在此片段只有一个核苷酸与其不同，是A到C的改变。其余9株测序结果也不同于Jin L(1997)^［5］报道的英国(Ⅰ-Ⅲ)及Rima等(1995)^［9］报道的其他国家MV流行株(A-G)基因型，所以本文称之新基因型。无根基因树分析图形看SY2 China97株分在ED-like组，其它9株在新基因型组见图1。MV-N基因C末端氨基酸测定分析也同样显示此结果，SY2 China97株与EDw54株相同，其余9株均有8AA不同于EDw54株和疫苗株，个别MV株另外还有1-4AA的改变。

图1中国MV流行株(新基因型)与国外报道的MV基因型在N基因nt 1235-1516序列的基因关系：无根树形使用NDAStar Packge中分组程序绘制，括号内A-G是Rima等1997年设定的基因型，UK MV株来源参考Jin 1997的报道。

另外计算机分析中国MV流行株N基因核苷酸片段序列与EDw54株、疫苗株及其它国家其它基因型核苷酸片段的百分差异看，SY2 China97与EDw54株相差为零，与疫苗株相差0.4%，其余9株(新基因型)与疫苗株和EDw54株相差7.1%～8.8%，与其它国家其它基因型最大差异为15.4%，中国MV新基因型内之间相差0%～3.7%。还可以看出同一爆发点的DL1 Ch95n、DL2 Ch95n及HLD30 China97n、HLD32 China97n的基因序列完全相同。

四、MV-H基因(450nt nt628-1080)核苷酸片段序列测序分析结果：按N基因选择毒株条件取18株H基因RT-PCR阳性株，做450nt片段测序分析，结果同样显示SY2 China97为ED-like组基因型，其它17株均属新基因型，与其它国家报道的MV流行株450nt H基因无根基因树形见图2。

图2中国MV流行株(新基因型)与国外报道的基因型在H基因nt 628-1080序列的基因关系：无根树形使用NDAStar Packge中分组程序绘制，括号内A-F是Rima等1997年设定的基因型，UK MV株来源参考Jin 1997的报道。

从核苷酸百分差异分析看，SY2 China97株与EDw54、疫苗株完全相同，其它17株与其相差3.4%～7.6%，17株之间相差0%～7.3%。同样显示同一爆发点MV毒株SY16 China97、SY17 China97 H 基因片段序列完全相同。还可证明辽宁省1997年阜新MV流行株(FX23 China97)、沈阳、葫芦岛市MV流行株(SY5、13 China97；HLD36 China97)H 基因序列相同；河南省(HN3 China97)MV流行株与沈阳(SY12 China97)MV流行株也相同；河北省的HB38 China97 MV流行株H基因序列与辽宁、河南省的MV流行株核苷酸百分差异较大(6.3%～7.6%)。盘锦的PJ51、PJ55 China97 MV流行株为同一地区同一时间不同爆发点的MV流行株，核苷酸序列也有所不同。

讨论

1.MV-N、H基因核苷酸片段序列分析(282nt 450nt)结果表明基因型相一致，说明本研究选用的MV-H、N基因引物可以用作MV基因型分析。另外证明用RT-PCR方法测定麻疹病人急性期唾液、尿液样品中的MV-RNA是一种快速的MV病原学诊断方法。RT-PCR产物纯化后进行核苷酸片段测序，MV基因型分析也是一种快速、简便的方法。

2.1995～1997年期间，辽宁、河南、河北省的MV流行株有两种基因型，其中一种为ED-like型，占流行株的少数，只发现1株；另一种基因型(新基因型)占流行株的绝大多数，并与CDC所做的中国1993、1994年湖南、北京、山东MV流行株基因型相一致。

3.MV-N、H两种基因核苷酸片段测序分析还证明：中国1995～1997年期间部分地区流行的MV野毒株基因型不同于1954年首次分离的EDw54野毒株和现用的疫苗株，MV-N基因各基因型之间的核苷酸百分差异较H基因大，此结果与国外报道的结果相一致^［10］。

参考文献

1Kreis Stephanie,Whistler Toni.Rapid identification of mesales virus strains by heteroduplex obility assay.Virus Research,1997,47∶197-203.

2Tamin Azaibi,Rota PA,Wang Zhongde,et al.Antigenic Analysis of current wild type and vaccine strains of the measles virus. J Infect Dis,1994,170∶795-799.

3Rota PA,Rota Jennifer S,Bellini William J. Molecular Epidemiology of measles