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1.菌株：问号钩体4种血清型(赖型、犬型、秋季型和波摩那型)标准菌株由广东省卫生防疫站提供。
2.钩体DNA提取：钩体培养物离心后，加1%SDS及终浓度40μg/ml的ProtinaseK于37℃水浴裂解菌体，以等体积酚：氯仿抽提3次，然后以等体积异丙醇低温沉淀DNA，沉淀物用70%乙醇洗涤2次，干燥后溶于适量TE中备用。
3.患者血清标本处理：取血清50μl及硅粒液40μl加入900μl裂解液中〔裂解液配制：120g guSCN加100ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，加22ml 0.2mol/L EDTA(pH8.0)和2.6gTriton x-100，搅溶〕，旋涡5秒钟，室温置10分钟，再旋涡5秒。1 200g离心15秒。弃上清，用冲洗液(120g GuSCN加100ml 0.1mol/L tris-HCl pH6.4)、 70%乙醇各洗涤2次，丙酮洗涤1次，弃上清后于56℃干燥10分钟，加入50μl TE并旋涡，置56℃ 10分钟，12000g离心2分钟，取上清备用。
4.PCR引物设计及合成：参照钩体16S rRNA基因序列，设计出一对引物R1、R2，扩增片段长度为270bp。引物序列为：R1：5’-43 CGCGTCTTAAACA
tGCAAGTCAAGC-3’(G＋C mol%＝48.0%)；R2：5’-312CCCGTGTTACCTTGACTCT-3’(G＋C mol%＝52.6%)。
5.PCR扩增分析及对患者血清标本的检测：取钩体DNA抽提液5μl(0.1ng)或患者血清抽提物40μl进行扩增反应，每个循环包括：95℃解链1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环。每管取扩增后产物5μl，电泳检测扩增结果。
二、结果与讨论：对钩体病流行期的15例疑似患者PCR检测结果为7例阳性，与临床确诊的7例患者完全符合(先后由当地防疫部门采用血培养及血清学试验确证)，阳性符合率为100%，明显高于医院常规方法(MAT)的检出率(采样时确诊5例阳性)，且PCR检测中设立了阳性、阴性对照，保证了结果的可信度，说明采用的PCR检测方法，快速、简便且准确率高。
(收稿：1998-04-16修回：1998-05-20)
