中华流行病学杂志2000年第21卷第6期

黄芳俞东征海荣蔡虹

摘要目的对来自全国不同疫源地、不同生态型的103株鼠疫耶尔森氏菌进行基因分型研究。方法用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）。结果将鼠疫耶尔森氏菌分成两种基因型别：全国大部分菌株为RAPD-1型，青海省境内的大部分菌株为RAPD-2型。结论不同生态型的鼠疫耶尔森氏菌基因结构存在差异，为鼠疫耶尔森氏菌的基础研究和防治提供依据。

关键词：鼠疫耶尔森氏菌；随机扩增多态性DNA技术

鼠疫，是一种曾给人类带来巨大灾难的烈性传染性疾病。历史上的三次世界性大流行，造成约两亿人口的死亡。鼠疫的流行表现为时起时伏，进入90年代以来，鼠疫发病率呈上升趋势^［1］。为准确鉴别不同地区、不同时代、不同流行过程中的鼠疫耶尔森氏菌（鼠疫菌），彻底弄清鼠疫菌侵袭人类的规律，鼠疫自然疫源地存在与活动的规律，需要对鼠疫菌进行基因分型。目前，我国鼠疫菌采用的生态型分型方法属于表型分型方法，用于分型的表型特征都依赖于特定基因在体外表达的稳定性^［2］，不能从根本上揭示各菌株之间的亲缘关系，而基因分型则从遗传物质的结构特征着手，根据核苷酸水平的多态性来区分不同的菌株。本研究采用的随机扩增多态性DNA技术（RAPD）是90年代初发展起来的新的基因分型方法^［3，4］，它是利用单一的任意序列的引物，随机地与靶序列完全或部分配对，以扩增出特异的DNA产物，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电泳条带的不同直接对细菌进行分型。它最显著的优点是：事先不需要知道目的基因组的任何序列信息，便可直接用一任意序列的引物对整个基因组进行分析，简单、快速、分辨力高^［5-8］。用此方法，我们对来自全国不同疫源地、不同生态型的103株鼠疫菌进行研究，旨在探索一种新的鼠疫菌基因分型方法。

材料与方法

一、材料

1.菌株来源：试验所用103株鼠疫菌由青海鼠疫菌菌株保存中心提供。其中包括全国8个省9种自然疫源地、17个生态型的菌株。17个生态型103株菌中，青藏高原生态型10株（青海境内5株，甘肃、西藏两地境内5株），祁连山生态型10株（青海境内5株，甘肃、西藏两地境内5株），滇闽生态型15株，昆仑山B型3株菌，其余13个生态型均为5株菌。

2.主要设备：PCR扩增仪（中国科学院遗传所TC-96AE型水浴式温度循环仪），高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），水平电泳仪（北京东方仪器厂），紫外检测仪（永嘉上塘教学仪器厂）。

3.主要试剂：Taq DNA聚合酶购自上海生工生物工程公司，分子量标准λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ购自华美生物工程公司。阳性对照菌株E. coli BL21 DNA由美国疾病控制中心（CDC）提供。

二、方法

1.引物设计：根据Pharmacia Biotech的RAPD试剂盒（RAPD Analysis beads）中的引物2的序列，设计、合成一条10个碱基的引物，引物的序列：5′-GTTTCGCTCC-3′。

2.RAPD分析：RAPD PCR反应体系为25 μl，包括：模板DNA（25 ng/μl）：2.0μl；引物（25 μmol/L）：2.0 μl；dNTP(10 mmol/L)：2.0 μl；10×PCR buffer(free MgCl₂ ）：2.5 μl；MgCl₂(25 mmol/L)：3.0μl；Taq DNA聚合酶（4 U/μl）：0.25 μl；三蒸水：13.25 μl。充分混匀后，加25μl石蜡覆盖。PCR循环条件：变性：95℃，1min（首轮循环5min）；复性：36℃，1min；延伸：72℃，2min，45个循环。

结果

103株鼠疫菌被分成两种RAPD型别：RAPD-1型、RAPD-2型。其中RAPD-1型占93%，包括全国大部分菌株；RAPD-2型占7%，主要包括青海境内的大部分青藏高原型、祁连山型两种生态型的菌株（图1）。

图1中国鼠疫耶尔森氏菌的RAPD分型结果

同属于青藏高原生态型、祁连山生态型的青海、西藏、甘肃3省的菌株呈现不同的RAPD型别。青海境内的两种生态型的10株菌中的8株为RAPD-2型（图2），甘肃、西藏两地境内的两种生态型的10株菌都为RAPD-1(参见图1中的6～12泳道)。

为保证每次结果的重复性、可比性，每次RAPD分析都加了标准菌株E.coli bL21作阳性对照，如图1中的泳道3。

图2青海省的青藏高原型、祁连山型菌株的

rAPD分型结果

讨论

鼠疫是一种自然疫源性疾病。不同地理条件、生物群落组成形成不同的菌株。80年代初，我国鼠疫专家纪树立等人根据生化指标、F1抗原含量、内毒素含量、Pgm⁺细胞突变为Pgm^－的速率等14个指标将我国的鼠疫菌分成17个生态型。不同的生态型对人的侵袭力、致病力均不同。通过对鼠疫菌在离体人血清中的生长速率、F1抗原含量、内毒素含量的分析，推测青藏高原型、祁连山型的鼠疫菌致病性最强。流行病学资料也表明，不同生态型所在地的鼠疫的发病率、病死率有很大差异，其中青藏高原型、祁连山型所在地的疫情不断，病情重，病死率高，且减毒疫苗预防效果差。除其他的流行病学因素外，这些差异最根本的原因是其基因的不同。本次RAPD分型结果表明，一部分的青藏高原型、祁连山型的菌株不同于全国其他大部分地区的菌株，而独成RAPD-2型。这些菌株很可能是造成该生态型致病力强，该地流行情况严重的根本原因，从而一定程度上揭示了流行病学资料和生态型的遗传学基础。

另一方面，同一生态型的鼠疫菌则可能受当地地理环境、动物宿主、媒介昆虫等生态组成成分变化的影响，而发生遗传变异，这些变异经过长期自然选择而保存下来，从而形成不同于原来菌株的新的基因菌型。如青海的大部分菌独为RAPD-2型，很可能就是这些基因突变的结果。这些突变株在本地区的鼠疫流行中占据选择优势，因而所分离的大部分鼠疫菌都是这种基因型别，但原来突变以前的菌型并没有完全消失，还在个别地段、个别宿主中存在，偶尔也可分离到，如12014、13014菌株。基因突变株可以随着动物宿主、媒介昆虫的流动而传播，在另一些生态环境相似的地方存活下来，但这种传播受一些外界条件的限制。如与青海毗邻的、同属于青藏高原型与祁连山型的甘肃、西藏的菌株，却没有发现RAPD-2型，而同全国的大部分菌株一样，为RAPD-1型，这可能是因为青海与甘肃和西藏分别隔着祁连山山脉和唐古拉山山脉，这些山脉海拔多在5500 m以上，山顶为裸岩地带，无植被，且终年积雪，形成一道地理屏障，而使青海成为一个独立自然疫源地，这里发生的基因突变很难翻越这样的大山脉而传播过去，只得局限于山的一侧，于是，分居于山脉两侧的同一生态型而呈不同的RAPD基因型。将基因分型与生态分型结合起来分析，将对鼠疫的基础研究和防治工作起重要的指导作用。

RAPD方法灵敏度高，很多因素如酶、氯化镁、模板、循环条件、PCR仪等都影响其结果的重复性^［9-12］。因此，要想得到稳定可靠的结果，除严格按照PCR控制污染的操作规范外，可每次设一个标准菌株作阳性对照，如本实验的BL21。如条件许可，最好是将除模板、水以外的所有的RAPD反应组分做成试剂盒，这样操作更简便，重复性更强。

作者单位：黄芳（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所鼠疫研究室，北京，102206)

俞东征（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所鼠疫研究室，北京，102206)

海荣（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所鼠疫研究室，北京，102206)

蔡虹（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所鼠疫研究室，北京，102206）

参考文献

1，李书宝.中国鼠疫监测现状及疫情态势分析.中国地方病防治杂志，1999，14∶278-280.

2，Maslow JN, Mulligan ME, Arbert RD. Molecular epidemiology: application of contemporary techniques to the typing of microorganisms. Clin Infect Dis，1993,17∶153-164.

3，Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res，1990,18∶6531-6535.

4，Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res， 1990, 18∶7213-7218.

5，Damiani G. Comparison of a improved RAPD fingerprinting with different typing methods for discriminating clinical isolates of staphlococus spp. Eur J epidemiol，1997, 12∶163-169.

6，Micheli MR, Bova R, Pascale E, et al. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified pol