军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期

黄祥瑞陈娟李晓萸杨秀旭吴庆丽李德荣

摘要目的：了解从西藏血蜱标本中分离的环状病毒（Ti3010）的细胞生物学特性和敏感细胞范围，与国内其他地区环状病毒进行比较，为全面认识西藏地区环状病毒的特点和进一步确切分类提供依据。方法：将病毒平行接种BHK₁₃、Vero、C6/36、HeLa4种细胞，逐日观察病毒的致细胞病变效应（CPE），特异荧光发生部位和细胞数量，超薄切片电镜观察病毒的形态发生以及进行TCID₅₀滴定。结果与结论：Ti3010环状病毒接种BHK₁₃细胞后第3天产生CPE，32%～35%的细胞有病毒增殖，胞浆内检出特异荧光；电镜观察到胞浆内的病毒颗粒呈聚集状态，多呈晶格状排列，并具有病毒包涵体。TCID₅₀滴定在BHK₁₃细胞为7.1，Vero为5.8，C6/36和HeLa为0。结果显示Ti3010病毒与从鸟、鼠等标本中分离的Ti2066和Ti2076病毒一样，对BHK细胞敏感，产生CPE；Vero细胞次之，对C6/36和HeLa细胞不敏感，在BHK₁₃细胞中上述3株病毒具有相同的复制特点。结合其RNA基因组特点，该病毒同国内其他地区分离的环状病毒有较大差异，该差异显示了西藏地区特殊生态环境下环状病毒的独有性状。

关键词：环状病毒；致细胞病变效应；免疫荧光测定；蜱

环状病毒分为13个血清群^［1］，其中许多对人致病，大部分对家畜致病^［2］。国内徐普庭等^［3］从云南等地的蚊、人血清标本中曾分离出多株环状病毒（如YN141、YN187），其生物学性状只对C6/36细胞敏感，对乳鼠不致病。我们从西藏鸟、鼠等标本中分离的环状病毒对BHK细胞敏感，对乳鼠致死，基因组RNA带型和相对分子量与YN141、YN187亦不同^［4］。为全面了解西藏地区多种标本分离的病毒特性，我们对蜱标本中分离的环状病毒^［5］的细胞生物学性状进行了研究，为阐明该地区特殊生态环境下环状病毒的独有性状及进一步分类提供依据。

1材料与方法

1.1毒种与细胞

Ti3010病毒株从西藏血蜱（Haemaphysalis tibetensis Hoogstraal，1965）中分离、Ti2076从西藏亚东地区锡金松田鼠（Pitymys sikimensis Hodgson，1849）中分离，试验用毒株分别为第6代和第7代细胞悬液。BHK₁₃、Vero、C6/36、和HeLa细胞均由本所微生物检测中心细胞库提供，细胞生长液RPMI1640含10%新生小牛血清，维持液1640含2%新生小牛血清。

1.2TCID₅₀滴定

按常规方法进行。

1.3病毒感染及抗原片的制备

细胞单层平行接种Ti3010和Ti2076病毒1 000 TCID₅₀/ml，室温吸附90 min，弃去剩余病毒液，加入维持液，37℃孵育；同时设4种细胞的正常对照。逐日观察CPE并于接种病毒后72 h和96 h按常规方法制备抗原片。

1.4免疫血清和羊抗兔IgG荧光标记抗体的制备

按常规方法进行。

1.5超薄切片及负染色

以常规方法进行。

2结果

2.1细胞病变效应（CPE）

Ti3010病毒接种上述4种细胞后,出现了完全不同的结果，在BHK₁₃细胞上96 h时出现明显的CPE，细胞圆缩、破碎、拉网状脱落。在Vero细胞亦可见轻微的CPE，圆缩细胞呈葡萄串状，病变进程慢。在C6/36和HeLa细胞上未见到CPE，与正常对照细胞无区别（图1）。

图1Ti3010病毒接种BHK₁₃（A）、Vero（B）、C6/36（C）和HeLa（D）细胞后96 h的结果

e为BHK₁₃细胞96 h对照

2.2TCID₅₀滴定

进行了Ti3010病毒对4种细胞的TCID₅₀滴定，以Read muench方法计算的lg值分别为：BHK₁₃=7.1，Vero=5.8，C6/36=0，HeLa=0。Ti2076病毒在BHK₁₃细胞上的对照值为7.3。

2.3病毒在细胞内的增殖

病毒接种后第3天在BHK₁₃细胞胞浆内可见到数目众多、发育增殖良好的病毒颗粒，更多的见于胞浆内病毒性包涵体和扩张的粗面内质网上。病毒密度梯度离心纯化后经阴性负染，可见病毒颗粒呈圆球形，双层衣壳，表面微结构清晰，直径为（70±10）nm（图2）。在Vero细胞胞浆中亦可见到少量病毒颗粒。在C6/36和HeLa两种细胞中未见病毒颗粒复制。Ti3010病毒的复制特点同Ti2076病毒一致。

2.4间接免疫荧光染色

Ti3010病毒接种4种细胞后72 h制片，经间接免疫荧光(IIFA)染色，观察到病毒在4种细胞内的复制及敏感性有十分明显的差别。经3次重复试验，每次计数10个视野，镜检计数发出特异荧光的阳性细胞率分别为：BHK₁₃=32%～35%，Vero=17%～20%，C6/36=0%，HeLa=0%发；96 h制片，具有特异荧光的阳性细胞在BHK₁₃为2/3，在Vero为1/3。

图2Ti3010病毒感染BHK₁₃细胞后

72 h的超薄切片电镜观察结果左上为阴性负染可见完整的病毒颗粒（×10⁵）

图3Ti3010病毒接种BHK₁₃（A）、Vero（B）、C6/36（C）和HeLa（D）细胞后72 h的间接免疫荧光染色结果

3讨论

Ti3010病毒对BHK₁₃细胞的敏感性同Ti2076和Ti2066一样；在Vero细胞上，虽能见到CPE，但时间滞后，且强度较弱。另两种细胞均无CPE。在IIFA染色实验中，也观察到了与上述结果一致的情况。当用10²～10⁴ tCID₅₀/ml的不同病毒量接种细胞，从第3天开始，逐日染片观察，发现细胞在72 h时胞浆内出现特异荧光的细胞达30%～35%，在96 h时2/3以上的细胞均有特异荧光，并清晰可见多数细胞整个胞浆全部发亮，有的细胞部分胞浆发亮等现象。在Vero细胞上，72 h时只有17%～20%的细胞有特异荧光，且有的细胞整个胞浆荧光强度不同，荧光亮度也稍弱，在96 h该细胞中1/3的细胞可见特异荧光，表明病毒在Vero细胞中复制和释放较慢。在另两种细胞，即使接种10⁴ tCID₅₀/ml病毒，72 h时只在个别视野中能见到单个发特异荧光的细胞，96 h时染片，这种细胞的数量并不增多，荧光亮度亦不增强。而且还发现，当接种10² tCID₅₀/ml病毒时，几乎就找不到发出特异荧光的细胞。这说明后两种细胞对Ti3010病毒不敏感，病毒未进入到细胞，偶尔有病毒进入，有所复制但不释放。电镜超薄切片观察亦证实了这一点。

我们的实验与Koonin报道^［6］从蜱、蚊或其他标本中分离的环状病毒均对BHK细胞敏感，以及Attoui等^［7］在对美洲、欧洲分离的一些环状病毒和Colti属病毒的研究工作中，用BHK细胞繁殖病毒的结果是一致的。然而，与国内文献报道^［3］从云南等地分离的环状病毒只对C6/36细胞敏感等生物学性状有明显差异，而且基因组dsRNA片段的带型和分子量亦不同。可见，本研究反映了西藏地区特殊生态环境中环状病毒的独有特点，它是否为环状病毒属中的新成员，有待其基因组序列分析结果证实。

［基金项目］国家自然科学基金资助项目(39870019)

［作者简介］黄祥瑞(1941-)，男，四川岳池人，副研究员。

黄祥瑞（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850)

陈娟（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850)

李晓萸（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850)

杨秀旭（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850)

吴庆丽（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850)

李德荣（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850）

参考文献

［1］Pritchard lI, Gould AR. Phylogenetic comparison of the serotype-specific VP2 protein of blue tongue and related orbiviruses［J］. Virus Res,1995,39(2-3):207.

［2］Gould AR, Hyatt AD.The orbivirus genus. Diversity, structure, replication and phylogenetic relationships［J］. Comp Immunol Microbiol Infect dis, 1994, 17(3):163.

［3］徐普庭，