第三军医大学学报2000年第22卷第6期

代芊邓宏黄汉朝王晓辉张红艳

摘要： 目的为确证胃→咽→下呼吸道逆行感染途径存在与否，研究胃液pH值变化与院内感染性肺炎(Nosocomial pneumonia,NP)发生的关系。方法以气管切开(或插管)病人为对象，用防污染标本刷(PSB)采集标本，由细菌表型分型，直至质粒DNA、酶切、随机扩增多态性DNA(RAPD)等基因分型，前瞻性观察NP的发生情况。结果11名患者有逆行感染存在(发生率为22%)，即在胃部分离出病原菌1、2 d后，PSB在咽部及下呼吸道也检出相同的细菌，应用质粒图谱、酶切图谱和RAPD等分子生物学技术进行同源性分析，证明其具有很高的同源性。将美蓝经胃管注入病人胃内，1、2 d后在咽部及下呼吸道可检出蓝色分泌物。随着胃液pH值升高，胃内细菌定植增加，NP的发生率升高。结论存在胃→咽→下呼吸道的逆行感染途径。NP的发生与胃液pH值显著相关。

关键词：随机扩增多态性DNA(RAPD)；院内感染性肺炎(NP)；逆行感染

关于院内感染性肺炎(Nosocomial pneumonia,NP)是否存在胃→咽→下呼吸道的逆行感染途径一直存有争议^［1～3］，且以往有关研究多限于细菌的表型分型或质粒图谱分析，缺乏基因组DNA水平上的确凿证据。本研究以气管切开(或插管)病人为对象，用防污染标本刷(PSB)采集下呼吸道分泌物，同时采集胃液，应用质粒DNA图谱、酶切图谱分析及随机扩增的多态性DNA(RAPD)等分子生物学技术，由细菌表型分型直至基因分型，前瞻性研究逆行感染途径存在与否。同时研究胃液pH值变化与NP发生的关系，为NP的预防提供可靠的实验依据。

1材料与方法

1.1研究对象1998年7月至1999年6月选择3所教学医院脑外科、神经内科行气管切开或插管的患者。按全国医院感染监控中心制订的诊断标准确诊NP^［4］，年龄≤15岁，确诊为肺部感染时间≤48 h者除外。发生NP的归为病例组，未发生NP的为对照组。二组年龄、性别、基础病、病情程度经均衡性检验具有良好的可比性。

1.2标本采集及鉴定

自患者行气管切开或插管之日起，用PSB采集下呼吸道分泌物，同时采集空腹胃液作细菌定量培养并测定pH值，每1～2d1次。用美国DADE-Microscan自动微生物分析系统进行生化及耐药谱鉴定。采用成都生物制品研究所生产的血清诊断试剂盒进行血清学分型。

1.3基因分型

对上述来自胃和下呼吸道细菌表型鉴定结果相同者，进一步作质粒DNA、酶切图谱分型，在此基础上分别选用二种随机引物Primer1:5′-GCAGGTGG-3′和Primer 2:5′-AGCCACCATG-3′进行RAPD基因分型。反应体系为25μl，含引物2.0 μmol/L, 4×dNTP125 μmol/L, MgCl₂ 4.0mmol/L，模板1μl，阴性对照除不加模板外，其余条件与样本管相同。反应条件为94°C90 s、42°C 90 s、72°C 60 s，40个循环。

1.4统计学处理

采用第四军医大学SPLM统计程序包，进行t检验、χ²检验、曲线拟合、直线相关回归分析，显著水准一律取α=0.05。对部分细菌表型鉴定结果及RAPD基因组指纹图谱进行聚类分析，以中国科学院微生物研究所MINTS数值分类软件包进行处理，聚类方式为平均链锁聚类方式。

2结果与分析

纳入研究的108例患者中，男84例，女24例，年龄16～83岁，平均年龄为(47.7±14.6)岁。将确诊为肺部感染的50例归为病例组，NP的发生率为46.3%(50/108)。PSB采样有76例次出现有诊断意义(＞10³ cfu/ml)的结果，分离到76株细菌，包括革兰氏阳性菌23株，阴性菌45株，真菌8株。胃液细菌培养分离到68株菌，包括革兰氏阳性菌11株，阴性菌50株，真菌7株。有22株菌(分别来自11名患者的胃部和肺部)在胃液分离鉴定出1～2 d后，在肺PSB也分离到相同的细菌，且连续2～3次采样均得到一致的结果。对其中6名患者将美蓝经胃管注入胃内，第2天在患者咽部用咽拭子可检出蓝色分泌物，PSB在下呼吸道也有蓝色分泌物检出，初步证明有逆行途径存在。逆行感染发生率为10.2%(11/108)占感染病例的22%(11/50)。来源于同一病人的肺、胃部表型鉴定结果相同的菌株，其质粒DNA图谱HindⅢ酶切电泳图谱完全相同，提示它们在质粒DNA水平具有很高的同源性。更有意义的是RAPD在各对应菌株之间得到完全相同的扩增带，见图1～3。MINTS聚类分析相似系数为100%，从基因组DNA水平进一步说明它们很可能为同源菌株。至此由细菌表型特征到基因组DNA水平均证明存在胃→咽→下呼吸道逆行感染途径。

图1各菌株RAPD图谱(1)

fig 1Bacteria profiles of RAPD generatedby different primers(1)

a:PCR marker; B:Negative; C:P.Aeruginosa from stomach(Primer 1); D:P.Aeruginosa from lung(Primer 1); E:P.Aeruginosa from stomach(Primer 2);F:P.Aeruginosa from lung(Primer 2); G:E.coli from stomach(Primer 1); H:E.coli from lung(Primer 1); i:E.coli from stomach(Primer 2); J:E.coli from lung(Primer 2)

图2各菌株RAPD图谱(2)

fig 2Bacteria profiles of RAPD generatedby different primers(2)

a:PCR marker; B:Negative; C:K.pnemoniae from stomach(Primer 1); D:K.pnemoniae from lung(Primer 1); E:K.pnemoniae from stomach(Primer 2);F:K.pnemoniae from lung(Primer 2); G:P.Maltophilia from stomach(Primer 1); H:P.Maltophilia from lung(Primer 1); I:P.Maltophilia from stomach(Primer 2); J:P.Maltophilia from lung(Primer 2)

图3各菌株RAPD图谱(3)

fig 3Bacteria profiles of RAPD generated

by different primers(3)

a：P.alcaligenes faecalis from stomach(Primer 1)； B:P.alcaligenes faecalis from lung(Primer 1)； C：P.alcaligenes faecalis from stomach(Primer 2)； d:P.alcaligenes faecalis from lung(Primer 2)； E:Negative; F:PCR marker

在测定胃液pH值的同时，计数该pH环境下胃内细菌总数。结果表明随着胃液pH值的升高，胃内定植细菌总数明显增加，两者呈显著相关(P＜0.01)。病例组pH均值(4.89±1.48)，对照组pH均值3.27±1.19,P＜0.01。按pH≥4及pH＜4将病例组分为2组，当pH＜4时NP的发生占26%，pH≥4时，NP的发生占74%，χ²=32.94，P＜0.01，即随着胃液pH值的升高，NP的发生率显著增高。

3讨论

国内报道NP的发病率为23.3%～42.0%，国外资料为19.5%～19.7%^［5］。本实验NP的发病率为46.3%，高于文献报道，与本研究对象多为病情重，有昏迷并接受气管切开(或插管)的病例加之使用PSB采样提高了检出率有关。

关于是否存在胃→咽→下呼吸道的逆行感染途径问题，观点不尽一致。本组50例NP病人中，发现有11例患者存在胃→咽→下呼吸道的逆行感染。即在胃内分离出病原菌，1～2 d后，在肺PSB采样也分离到表型和基因型均相同的病原菌，美蓝试验也佐证逆行感染途径的存在。大多文献对院内感染的同源性分析多限于表型鉴定，如细菌形态、生化反应、血清学特点、耐药谱等，这些鉴定虽很重要，但比较肤浅，只能达到型或亚型的水平。目前认为在表型特征一致的情况下，尚须从基因结构上分析。RAPD技术具快速、简捷、高效的优点，甚至可以区分一个碱基的差异，是一种新型遗传标记检测技术，其结果更为准确可靠。

关于逆行感染的发生，近来研究认为主要原因之一是由于胃食管反流症的结果。尤其强调食管下端括约肌暂时和持久松弛作用的重要性^［6］。在危重病人和老年人这种力学作用尤为突出，加上胃排空以及长期放置胃管，刺激咽部，极易引起反流，将胃内细菌带至咽部进而入下呼吸道引起感染。此外食道下端括约肌的持久松弛，使得胃内细菌可沿管壁逆行上移至咽，再进入下呼吸道。这还与病人所处的体位有关。

关于胃液pH值的变化是否与NP的发生率相关，尚无定论^［7～8］。本研究结果显示随着pH值升高，NP的发生率随之增高。正常胃液pH≈1.0，具有强大的杀菌作用。但当胃液pH≥4.0时(也有认为＞3.4)胃内细菌出现过度生长。目前认为应激性溃疡的预防用药是引起胃液pH升高的主要原因。在脑损伤等危重病人多常规使用制酸剂、H₂-受体阻断剂或/和质子泵抑制剂。这些药物主要是中和胃酸，抑制胃酸分泌，减轻H⁺对胃粘膜的损害，但与此同时又引起胃内环境碱化，细菌定植增加，NP的发病率升高。

总之