摘要：用酶联免疫吸附法检测食品等的真菌毒素的方法学研究进展很快。本文主要针对检测赭曲霉毒素A的方法，包括抗原、抗体的制备方法及酶联免疫吸附法的进展做一综述性介绍。

中图分类号：TS207.4R155.31文献标识码：B

文章编号：1000-8020(2000)06-0390-03

Determination of ochratoxin A by ELISA

Chen XuelanXu YangYuan Yongfang

（Sino-German Joint Research Institute,Nanchang330047,China）

Abstract：The determination of ochratoxin A by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),including the method of preparation of antigen and antibody,and the promising of ELISA in mycotoin determinations was introduced.

Key words:ochratoxin A,enzyme-linked immunosorbent assay

赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢产物。它包含7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的毒性最强(大鼠经口为20 mg/kg)。OTA具有烈性的肾脏毒和肝脏毒，当人畜摄入被这种毒素污染的食品及饲料后，就会发生急性或慢性中毒症，此外，据文献报道OTA还具有致癌、致畸和致突变性^［1，2］，因此对人体健康和畜牧业的发展都有很大的危害。

由于OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界，在目前条件下，要完全避免对食品及饲料的污染非常困难。除了在粮食收获、储存、加工各个环节科学作业、注意防霉去毒外，唯一有效的办法是加强对食品、饲料及其原材料的检测监控，及时发现污染的食品和饲料，并立即剔除，防止OTA超标污染的食品进入人类的食物链。

自van der Merve等1965年首次报道了OTA污染的各种饲料对雏鸭、大白鼠和小白鼠的毒性作用以来，世界各国有关学者对OTA进行了许多的研究。人们相继采用了薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等方法对其进行检测和分析。TLC是OTA早期研究中最常见的检测方法，因其操作简便曾被广泛应用。但这种方法较费时(48小时左右)，灵敏度和特异性较差，在OTA的提取过程中所需的有机溶剂品种多且量大^［3］。HPLC法具有更高的灵敏度，可以精确地对样品中的OTA进行定性和定量分析，但此法不适合于大批量样品的检测^［4］。由于ELISA法快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，发展非常迅速。

ELISA法是1971年荷兰学者van Weeman与Schurrs和瑞典学者Engvall与Perlman几乎同时提出的。其基本原理是在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体复合物，在酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成为另一种带色物质。在一定条件下，酶降解底物和呈现色泽是成正比的，因此可以用分光光度计进行测定，从而可以计算出参与反应的抗原和抗体的含量^［5］。ELISA检测法的核心反应是抗原抗体反应。

1抗原的制备

作为抗原必须具备两方面的特性：免疫原性和反应原性。免疫原性是指能够刺激机体产生抗体或诱导机体形成免疫应答反应的特性。反应原性是指能够与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性。根据这一要求，又把抗原分为完全抗原和半抗原。完全抗原是一些大分子物质(分子量一般大于10000)，如蛋白质、多糖等，具备上述两方面特性。而半抗原是一些只有反应原性而没有免疫原性的小分子物质。OTA属于半抗原，必须与大分子物质，如蛋白质，结合后才具有免疫原性^［6］。完全抗原的制备为OTA酶联免疫吸附法检测的第一步，能否得到稳定、具有良好抗原性的OTA与蛋白质连接物是整个ELISA法检测的关键。OTA分子中含有羰基，活化其羧基的方法主要有混和酸酐法(mixed acid anhydride,MA)、羰基二咪唑法(carbonyldimidazole,CDI)及活性酯法(actived ester method)。

1.1MA法

MA法也称氯甲酸异丁酯法(isobutylchloroformate method)，最早用于肽类化合物的合成。应用此法制备OTA与蛋白质的偶联物的反应分为二步，首先OTA与氯甲酸异丁酯在有机溶剂三乙基胺(triethylamine)中，低温、无水的条件下形成混合酸酐。然后与牛血清白蛋白分子中的氨基形成肽键，从而将OTA与蛋白质连接起来。此法由于氯甲酸异丁酯的部分活性基因引入了偶联物中，形成新的抗原决定基表位，而发生交叉反应^［7］。此外，当用这种方法制备的完全抗原作为包被抗原时，着色背景吸光值高，从而影响了ELISA法检测的特异性^［8］。

1.2CDI法

不使用任何中间偶联试剂，CDI能与蛋白质的氨基形成共价键，从而减少了中间试剂的干扰。而且，CDI与蛋白质的连接相对稳定，一般不会随温度变化而变化^［9］。此法若用于制备含羟基的真菌毒素抗原，则反应速度较慢；而用此法制备含羧基的真菌毒素抗原的反应速度相对较快。另外，此法克服了用MA法制备包被抗原着色背景吸光值高的缺点^［10］。Clarke等用此法制备牛血清白蛋白(BSA)与OTA的连接物，方法如下：1 mgOTA与1.5 mgCDI溶解于100μl丙酮中，在室温、避光条件下，不断振荡反应10 min^［11］。活化的OTA与CDI的混合物缓慢地滴加于BSA(BSA溶于1000μl 0.1 mol/L Na₂CO₃溶液中)溶液中，同时不断振荡，室温下避光反应2 h，然后透析即得偶联物。

1.3活性酯性

又称氮-羟基琥珀酰亚胺法(N-hydroxysuccinimide method,NHS法)。该法是CDI法的一种变型。NHS由二环己基碳二亚胺(dicylohexyl-carbodiimide,DCC)或另一种CDI试剂酯化而来^［5］。NHS法既克服了用MA法制备包被抗原着色背景吸光值高的缺点，又克服了CDI法用于制备含羟基真菌毒素的抗原反应时间长的缺点^［10］。另外，NHS法可以控制真菌毒素与蛋白质的连接比例。用NHS法制备OTA抗原方法如下：OTA与等摩尔的NHS、DCC溶解于无水四氢呋喃中，在室温、避光反应条件下，不断振荡反应1 h，离心，去沉淀，蒸发四氢呋喃，残留物溶于二甲基甲酰胺中。然后滴加入溶于0.13 mol/L Na₂CO₃的5%BSA溶液中，在室温、避光条件下，缓慢振荡30 min，最后透析得偶联物^{［7，10，12］}。

2抗体的制备

OTA抗体的制备方式分为多克隆抗体或单克隆抗体制备法。

2.1多克隆抗体的制备

据对小白鼠的研究推测其体内含有几亿个B细胞，在免疫原的刺激下，可产生几千万个B细胞系。其中，平均每10000个B细胞系中约有1个能产生针对特定抗原决定簇的抗体，因此每免疫1只动物，可有几千个细胞系能产生针对各种抗原决定簇的抗体。象这样通过直接免疫动物获得的抗体，称为多克隆抗体。可通过抗原免疫哺乳动物，如兔，获得兔抗血清，或免疫禽类，如鸡，获得鸡卵黄抗体(IgY)。

目前，OTA特异性多克隆抗体主要从免疫哺乳动物(如兔)获得。使用鸡卵黄抗体的报道较少，但已逐渐引起人们的重视。鸡蛋中的抗体是产蛋鸡将血清中的抗体移至蛋黄中形成的，它和血清中的抗体具有相同的特异性和灵敏度，从鸡蛋中提取抗体不需要采血，且抗体量较大^{［8，13，14］}，大量制备不受限制，同时不会因为多次制备而造成抗体的均一性差，来自一个母体的卵黄抗体类似于单克隆抗体的无限性。此外，它具有一些完全不同于哺乳动物免疫球蛋白(IgG)的特殊生物学特性，如不与金黄色葡萄球菌A蛋白结合；对哺乳动物的补体成分无固定作用；不结合哺乳动物的F_C受体；更为重要的是IgY不与血清中的类风湿因子反应，可以有效地避免许多免疫学测定中由于类风湿因子干扰而引起的阳性结果^［15］。

1993年Clarke等报道：用OTA-BSA免疫鸡，获得的鸡卵黄抗体用于间接竞争ELISA检测OTA与OTC(赭曲霉毒素C)、OTB(赭曲霉毒素B)、OTα(赭曲霉素素α)及结构类似的橘青霉的交叉反应分别为400%、100%、33.3%、2%；用间接竞争ELISA法检测在猪饲料中的OTA，最低检出限为50 ng/g。同时，用HPLC法检测同一物质中的OTA，发现用ELISA法与用HPLC法检测OTA的值的相关系数r=0.98。这一研究显示用ELISA检测从鸡卵黄中获得的抗体有较高的灵敏度和特异性^［8］。

2.2单克隆抗体的生产

由单个B细胞衍变的浆细胞产生的抗体，只针对抗原的某一决定簇有特异性免疫反应，这样的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体最早由Kohler和Milstein于1975年利用淋巴细胞杂交瘤技术获得。

2.2.1单克隆抗体的生产原理淋巴细胞在体内或体外被免疫激活后，可产生抗体，但在体外培养时，这些细胞最多只能生存10天～20天。解决免疫活性细胞在体外长期存活并毓殖的方法是将B细胞与能长期生存，不断繁殖的细胞(癌细胞)杂交(融和)，生产的杂交瘤细胞不仅具有癌细胞在体外迅速增长的能力，而且继承了免疫淋巴细胞的功能，携带免疫原特异信息，可大量合成特异性抗体^{［16，17］}。

2.2.2制备OTA<