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中图分类号：R730.54Q463文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)06-0372-03
Cloning of mouse endostatin and primary analysis on its biological activity
Jia ShidongZhu FuxiangLi HongweiHe Fuchuet al
（Institute of Microcirculation,Chinese Academy of Medical Sciences & P eking
Union Medical College,Beijing100005,China）
Abstract：The mouse endostatin cDNA was cloned by the total RNA of Chinese Kunming mouse liver as template with RT-PCR.The results of sequencing showed one base pair difference.The ctg was replaced by gtg(L22545 in GenBank)at position 278 base pair,causing the encoded amino acid from reported Val to Leu in this experiment.This new endostatin cDNA was registered in GenBank with an accession number of AF257775.The recombinant eukaryotic expression plasmid pSecTag2-ES was then constructed and transfected into COS-7 cells for transient expression.The results of testing by Western blotting showed an expression fragment in supernatants of pSecTag2-ES transfected COS-7 cells at 48 and 72 hours of transfection.Cultured HUVECs were used to detect the biological effect of supernatants in pSecTag2-ES transfected COS-7 after 48 hours of transfection.3H incorporation assay showed an obvious inhibition of endothelial cell proliferation.The results demonstrated primary that the cloned endostatin cDNA had biological activity.
Key words:endostatin, clone, angiogenesis
肿瘤的生长超过3mm3后就必须依赖于肿瘤组织中的新生血管形成(angiogenesis)来提供生长所必需的养分［1，2］。尽管完全切除原发肿瘤是肿瘤治疗最有效的方案，但在某些肿瘤中切除原发肿瘤常伴以其它位置的转移灶突然快速生长，诱发转移灶的新生血管形成。原发肿瘤的存在可抑制远处肿瘤转移灶的生长［3，4］。基于这些观察，Folkman等提出下列假设：原发肿瘤刺激自身血管床的新生血管形成，并抑制转移灶血管床或其它肿瘤的新生血管形成，即循环系统中新生血管形成抑制物/刺激物(angiogenesis inhibitor/angiogenesis stimulator)的平衡学说。内皮抑制素(endostatin,ES)最初是从小鼠EMOA(hemangioendothelioma cell line)细胞培养上清中分离出的一种20kDa蛋白，能特异性抑制内皮细胞增殖，是一种强效的新生血管形成抑制剂。序列分析显示，该蛋白序列与胶原酶(collagen ⅤⅩⅢ)的C末端片段100%同源［5，6］。
为了进一步探讨ES的临床潜在应用，本文以中国昆明小鼠肝脏总RNA作为模板，用RT-PCR的方法合成、扩增了ES cDNA，进行全长测序与国外文献报道的ES cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行了比较，并观察了其体外表达和对内皮细胞增殖的抑制作用。
1材料与方法
1.1菌株及质粒
大肠杆菌JM109由本室保存。克隆质粒pGEM-T为Promega公司产品，真核表达载体pSecTag2/Hygro B为Invitrogen公司产品。
1.2工具酶、试剂盒、抗体及主要生化试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶和TyroBest Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品，总RNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒及质粒纯化试剂盒为Promega公司产品，逆转录试剂盒及DMEM、M199培养基为Gibco公司产品，3H-TdR购自中国原子能科学研究院，6xHis单克隆抗体购自Invitrogen公司，HRP标记的二抗为中山生物工程公司产品，ECL Plus Western Blotting检测试剂盒购自Amersham Pharmacia公司，其它试剂均为国产或进口分析纯。
1.3引物
所用引物根据文献报道的ES cDNA序列设计［6］，上游为：5’GGA TCC TCT AGA CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CCA 3'(引入BamH I识别位点)，下游为：5’GAT ATC ACT CTA GAT TTG GAG AAA GAG GTC ATG AAG CTA 3'(引入EcoR V识别位点)，由大连宝生物公司合成。
1.4小鼠组织细胞总RNA的提取及ES cDNA的合成
昆明小鼠肝脏组织总RNA的提取及逆转录PCR合成ES cDNA，按试剂盒说明书进行。
1.5构建重组质粒pGEM-ES、序列测定、及真核表达载体pSecTag2-ES的构建
将PCR产物末端加尾后，按常规方法与pGEM-T载体进行连接，筛选获得阳性重组子pGEM-ES,对克隆的ES进行全长测序分析。用BamH I及EcoR V双酶切pGEM-ES获得ES片段，亚克隆于pSecTag2/HygroB载体中，经PCR初步筛选后，酶切鉴定，获得pSecTag2-ES。
1.6COS-7细胞、人脐静脉内皮细胞的培养及转染
COS-7细胞用含10%热灭活的新鲜小牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养。采用阳离子脂质体Lipofectamine介导pSecTag2-ES转染COS-7细胞，具体操作按转染试剂盒说明书进行。收集48h转染上清并提取细胞总蛋白。
用胶原酶消化法原代分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用含20%热灭活的新鲜胎牛血清的M199培养液加25μg/ml内皮细胞生长因子(ECGF)，于37℃、5%CO2条件下培养。
1.7Western印迹
选用6xHis单抗作一抗，具体操作按常规方法进行。
1.83H-TdR掺入实验
参考文献的方法进行［7］。
2结果
2.1ES cDNA的RT-PCR合成
在国外报道小鼠肝脏可提取到ES cDNA的基础上，本实验提取中国昆明小鼠肝脏总RNA为模板进行RT-PCR后，取10μl样品进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见到一明显的大小约500bp左右的特异性扩增片段，与预期产物的大小完全一致。用PCR产物回收试剂盒回收肝脏表达的ES cDNA片段、纯化特异性扩增片段，用于进一步克隆和鉴定(图1)。
图1RT-PCR产物琼脂糖电泳
2.2PCR产物的亚克隆、序列分析
将RT-PCR扩增得到的ES cDNA回收纯化后加尾，与pGEM-T克隆载体(3003bp)连接，转化大肠杆菌JM109，α互补筛选，挑选白色菌落，小量培养提取质粒，BamHⅠ和EcoR V酶切出现两个片段，分别为3.0kb和0.55kb，与理论计算的载体片段和ES片段大小相符，证明获得了阳性重组子pGEM-ES(如图2所示)。将经PCR和酶切鉴定后的阳性重组子全长测序，并与文献报道的小鼠ES cDNA序列进行对比分析。我们选取多个pGEM-ES克隆进行测序分析，结果表明所得序列完全一致。将测序结果与Folkman等报道的Endostatin cDNA序列相比，我们所克隆ES编码区cDNA与其报道的小鼠ES基因编码区cDNA序列同源性达99%，我们的测序结果在第278碱基处存在一个碱基差异(gtg→ctg)，导致编码的氨基酸由文献报道的Val变为Leu，表明我们所克隆的中国昆明小鼠ES cDNA与国外文献报道的序列有所差异，该序列已被GenBank收录(编号为AF257775)。由于我们实验中采用高保真的TyroBest Taq DNA聚合酶，而且用于测序的两独立的克隆株其测序结果完全一致，因此可基本排除PCR所致错误的可能性。此外，该点的核酸序列变异与GenBank上其他相关序列有相互印证之处，提示可能是动物种属 的品系差异所致。
图2pGEM-ES重组体的酶切鉴定
2.3真核表达载体的构建
常规分子克隆方法构建pSecTag2-ES。由于pSecTag2载体和ES片段上各存在一个ApaI酶切位点，pSecTag2-ES阳性重组子经ApaI酶切可切下5960bp和290bp的片段(如图3所示)。
