摘要：为探讨中国恶性肿瘤高发区粮食中优势污染霉菌毒素—杂色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)的致癌作用，运用银染PCR－SSCP方法分析了不同浓度的ST(1μg/ml和3μg/ml)对体外培养的人胚肺细胞恶性转化过程中抑癌基因p53第5、6、7、8外显子及癌基因Ki-ras的突变情况。结果显示ST处理后第22周，人胚肺成纤维细胞p53基因的第8外显子和Ki-ras癌基因均出现异常泳动带型，表明ST诱发了抑癌基因p53及癌基因Ki-ras突变，进一步证实了ST对人肺组织的致癌作用。

中图分类号：R155.31文献标识码：A

文章编号：1000-8020(2000)03-0175-03

Mutation of p53 and Ki-ras gene in human fetal lung

fibroblast cells in vitro by sterigmatocystin

Cao Wenjun, Wang Huiyan, Zhang Xianghong, Sun Xuming, et al.

(Institute of Basic Medical Science,Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017,China)

Abstract：To explore the carcinogenic effects of sterigmatocystin(ST), one of the predominant contaminating mycotoxins in high risk areas of cancer in China, mutation of tumor suppressor gene p53 and oncogene Ki-ras in human fetal lung cells in vitro induced by ST was studied using cell culture and silver-staining PCR-SSCP methods. The results showed that, within 22 weeks of ST treatment, no abnormalities were found for both p53 and Ki-ras gene in electrophoresis. Abnormal electrophoretic migration bands were seen at exon 8 of p53 gene and Ki-ras gene in ST-treated human lung fibroblast cells 22 weeks after ST treatment. Thus, the results further confirmed the carcinogenic effects of ST on human fetal lung tissue.

Key words:sterigmatocytin, lung neoplasms p53, ki-ras, mutation

杂色曲霉素(Sterigmatocystin, ST)是我国肿瘤高发区居民饮食中污染的最常见的具有致癌性的霉菌毒素之一，是非常重要的环境致癌物^［1～3］。作者既往研究发现，ST可诱导体外培养的人胚肺细胞发生恶性转化并使处理细胞癌基因ras p21和突变型抑癌基因p53蛋白表达增高^［4～5］。在上述研究工作的基础上，本研究以人胚肺组织体外培养和银染PCR-SSCP方法，分析了杂色曲霉素诱发体外培养的人胚肺成纤维细胞恶性转化过程中抑癌基因p53和癌基因Ki-ras的变化，以期进一步探讨杂色曲霉素的致癌作用。

1材料与方法

1.1人胚肺支气管组织培养

无菌条件下取5～6月龄胎儿支气管肺组织剪成1mm³大小组织块，接种于25ml培养瓶中，199培养基(日本制药株式会社)，37℃恒温箱，详见参考文献［4］。

1.2实验分组及处理

培养第4天，倒置显微镜下观察组织块周围出现细胞晕时，将培养组织随机分组，每组3瓶细胞，随机分为4组，其中第1、2组为杂色曲霉素处理组，分别加入以生理盐水稀释的不同浓度的杂色曲霉素(美国SIGMA公司)，使其终浓度分别为1μg/ml和3μg/ml；第3组为阳性对照组，加入致癌剂甲基硝基亚硝基胍(MNNG)1μg／ml；第4组为空白对照组，加入相应容量的生理盐水。

以上各组细胞均在处理24小时后，弃去含有致癌物的培养液，终止致癌物作用，更换新鲜培养液，密切观察，细胞长满培养瓶后及时传代分瓶。

1.3细胞p53、Ki-ras基因的PCR-SSCP分析

1.3.1细胞DNA的提取分别在ST处理后第24小时及第2、5、17、22周消化、收集各组细胞于15ml试管内，以PBS离心洗涤，然后将各组细胞分别集中于1个Eppendorf管中，以常规酚-氯仿法提取组织DNA，4℃保存备用。另取键康人外周静脉血20ml，提取其DNA作为对照。

1.3.2PCR引物p53基因第5、6、7、8外显子引物序列参考文献设计如下^［6］：

第5外显子

p1:5'-TTCCTCTTCCTGCAGTAC-3'

p2:5'-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3'；

第6外显子

p1:5'-CACTGATTGCTCTTAGGTCTGGC-3'

p2:5'-AGTTGCAAACCAGACCTCAGGCG-3'；

第7外显子

p1:5'-GGAATTCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3'

p2:5'-GGAATTCAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3';

第8外显子

p1:5'-GGAATTCCTATCCTGAGTAGTGGTAA-3'

p2:5'-GGAATTCCTGCTTGCTTACCTCG-3'。

Ki-ras基因引物序列选择12和13密码子相邻编码区设计如下：

P1:5'-GGCCTGCTGAAAATGACTGA-3'

P2:5'-ATTCGTCCACAAAATGATTC-3'

上述引物由中加合资上海生工(Sangon)生物工程有限公司合成。

1.3.3PCR反应分别以提取的DNA为模板，用上述引物对5～8个外显子及Ki-ras基因12和13密码子相邻编码区进行扩增，建立50 μl反应体系，扩增35个循环，变性温度94℃30s，退火60℃1 min，延伸72℃30s，最后循环结束时72℃反应5 min。

1.3.4SSCP分析取PCR扩增产物，加入甲酰胺使其浓度为95%，100℃水浴变性5分钟，于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中在16℃电泳，银染色法显示DNA条带。以正常人胚肺支气管组织DNA PCR扩增的p53及Ki-ras基因条带作为正常对照，确定实验样品的p53及Ki-ras突变带。

2结果

2.1PCR扩增结果

用标准分子量DNA作为参照(Marker)，分别于214bp(p53 exon5)、144p(p53 exon6)、128bp(p53 exon7)、160bp(p53 exon8)、176bp(Ki-ras基因12和13密码子相邻编码区)处见清晰的反应产物带型，与预期扩增产物分子量一致，无非特异带型出现(图1所示为exon 5扩增产物)。

M:Marker;Lc:正常人外周血淋巴细胞；L：空白对照组人胚肺成纤维细胞；L₁:ST 1μg/ml处理组；L₃:ST 3μg/ml处理组；L_M:MNNG 1μg/ml处理组

图1p⁵³ exon5 PCR 扩增结果

2.2SSCP分析结果

应用银染PCR-SSCP对ST处理组、MNNG阳性对照组、空白对照组及正常人外周血淋巴细胞的p53第5、6、7、8外显子和Ki-ras基因12和13密码子相邻编码区分别进行检测。同一胶板中与空白对照组及正常人外周血淋巴细胞相比，单链DNA带发生泳动变位者，即视为有突变。结果发现：22周前，对照及处理各组细胞p53第5、6、7、8外显子均未见异常泳动带出现。ST处理后22周，ST及MNNG处理组细胞在Exon 8出现了异常泳动带，表现为ST 3μg/ml及MNNG处理组的细胞1条泳动带消失，其它2条泳动带迁移率较正常为低，并且ST1μg/ml处理组的1条泳动带也较正常模糊(如图2)，说明p53基因第8外显子发生了突变。其余5、6、7外显子未检测到异常带型。

M：Marker;Lc:正常人外周血淋巴细胞；L：空白对照组人胚肺成纤维细胞；L₁:ST 1μg/ml处理组；L₃:ST 3μg/ml处理组；L_M：MNNG 1μgm/ml处理组。

图2ST处理体外培养的人胚肺成纤维细胞第

22周后银染PCR-SSCP的p53 exon8 检测

(L₁|L₃及L_M示突变带型)。

同时发现，22周前，对照及处理各组细胞Ki-ras12和13密码子相邻编码区均未见异常泳动带出现。但在ST处理后22周，ST处理组细胞出现了异常泳动带，表现为ST 3μg/ml处理组的细胞比对照组细胞增添了2条泳动带(见图3)，说明Ki-ras癌基因12和13密码子相邻编码区发生了突变。

M：Marker;L:空白对照组人胚肺成纤维细胞；

L₃：ST 3μg/ml处理组

3ST处理体外培养的人胚肺成纤维细胞第

22周后银染PCR-SSCPKi-ras癌基因12和13密

码子相邻编码区检测结果(L₃示突变带型)。

为保证结果的可靠性，对这些标本重复进行了银染SSCP分析，均得到相同结果。

3讨论