摘要：为探讨发育期锌缺乏降低脑组织微管聚合作用的可能机理，作者观察了孕期及哺乳期锌缺乏母鼠其仔代成年时的学习能力以及脑组织α微管蛋白(α-Tub)、β-微管蛋白(β-Tub)和微管相关蛋白2(MAP2)表达水平。给处于孕期及哺乳期ICR母鼠喂饲含不同锌水平的实验饲料，饲料锌水平分别为1、5、30及100mg/kg。在穿梭箱内检测实验仔鼠成年(70日龄)时的学习能力，然后采用Western blot技术检测其脑组织中α-Tub、β-Tub及MAP2的表达情况。行为学检测发现缺锌组(1和5mg/kg)达到学会标准所需次数明显多于非缺锌组(30及100mg/kg)，表明缺锌小鼠学习能力受损；比较各实验组α-Tub、β-Tub及MAP2表达量发现，缺锌组α-Tub、β-Tub及MAP2杂交信号明显弱于非缺锌组。蛋白表达量顺序均为1mg/kg组＜5mg/kg组＜30mg/kg组＜100mg/kg组，表明α-Tub、β-Tub及MAP2的表达水平与膳食锌呈正依赖关系。α-Tub、β-Tub及MAP2表达量降低可能是脑组织微管聚合作用下降的重要机制所在，并且与锌缺乏引发的脑功能损伤密切相关。

中图分类号：R151.2Q132.7文献标识码：A

文章编号：1000-8020(2000)03-0156-03

Mechanism of impairment to microtubule polymerization resulting

from zinc deficiency during pregnancy and lactation in mice

Wang Fudi, Zhao Faji, Guo Junsheng, Jing Naihe

(Department of Public Health, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)

Abstract：To probe into the mechanism of zinc deficiency on microtubule polymerization impairment, the learning ability and the levels of α-tubulin,β-tubulin and microtubule-associated protein 2 expression in the brain of zinc deficient offsprings, maternal ICR mice were fed with experiment diets containing different levels of zinc(1,5,30 and 100mg/kg) during pregnancy and lactation respectively.On the postnatal day 70 of offsprings, the learning ability and the expression of α-tubulin,β-tubulin and microtubule-associated protein 2 in the brain were examined by shuttle box and Western blot assays respectively. The results showed that the number of trials needed to reach the learning criterion for zinc deficient groups (1 and 5mg/kg)was much higher than that for non zinc deficient groups (30 and 100mg/kg).The levels of α-tubulin,β-tubulin and microtubule-associated protein 2 expression in the brain of zinc deficient offsprings (1 and 5mg/kg) were lower than those in the brain of offsprings whose dams fed with zinc adequatedly supplied diet (30mg/kg) and zinc supplemented supplied diet (100mg/kg) respectively. These results suggested that the inhibition of α-tubulin,β-tubulin and microtubule-associated protein 2 expression might be the most important mechanism of microtubule polymerization decline resulting from zinc deficiency, which had close relationship with brain function impairment.

Key words:zinc deficiency, brain function, tubulin, microtubule polymerization

微管是微管蛋白和许多微管相关蛋白(MAPs)组成的多聚体，是细胞骨架的重要成份之一^［1，2］。微管聚合作用在维持微管生理学作用中具有重要作用，而锌离子在维持微管蛋白结构及其聚合作用中具有重要作用。许多研究揭示锌离子可特异地与微管结合，锌单(Zn-sheets)就是微管蛋白重要结构之一，体外研究发现锌离子对大脑微管的组装起促进作用^［3～5］。一些动物实验研究发现，发育期(孕期和/或哺乳期)锌缺乏可引起实验大鼠脑微管聚合作用下降^［6］。但缺锌引发脑微管聚合作用下降的具体机理目前还不十分清楚。微管是由α-微管蛋白(α-Tub)及β-微管蛋白(β-Tub)形成的原微丝组成，每条原微丝由线性排列的微管蛋白以头尾相接构成。MAPs在α-Tub及β-Tub聚合形成二聚体及维持微管动力学稳态等方面发挥重要作用。微管相关蛋白2(MAP2)是MAPs家族中一种非常重要的调节因子^［2］。MAP2是微管组装的启动子，为神经元树突所必需，并且在神经元极性获得上发挥重要作用^［7］。为此本研究通过观察脑组织α-Tub、β-Tub及MAP2的表达，探讨发育期锌缺乏引发微管聚合作用下降的可能机理。

1材料与方法

1.1主要试剂

抗α-Tub单克隆抗体、抗β-Tub单克隆抗体、抗MAP2单克隆抗体、小牛白蛋白、过硫酸胺、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、溴氯吲哚基磷酸(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、丽春红S及Tween-20均为Sigma公司产品；AP标记的羊抗小鼠IgG为JIRL公司产品；正常羊血清(NGS)为Gibco BRL公司产品；聚丙烯酰胺、双丙烯酰胺(BIS)、乙二胺四乙酸(DETA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、尿素(urea)、二硫苏糖醇(DTT)、抑蛋白酶肽及Tris均为USB^TM产品；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；预染蛋白质分子量标准(分子量范围14 300-200 000)为Life Technologies公司产品；其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2实验动物分组及处理

ICR孕鼠80只，由中国科学院上海实验动物中心提供，体重为21～24g。按体重随机分为5组，分别是严重缺锌组(SZD，饲料含锌水平为1mg/kg)、轻度缺锌组(MZD，饲料含锌水平为5mg/kg)、适锌组(ZA，饲料含锌水平为30mg/kg)、高锌组(ZS，饲料含锌水平为100mg/kg)及高锌对照组(PF，饲料含锌水平为100mg/kg)。实验鼠在孕期及哺乳期均喂饲实验饲料，断奶期(20日龄，P20)后至成年(70日龄，P70)改喂普通市售饲料。实验饲料为参照美国营养协会报告的AIN－93G配方配制而成的纯合成饲料^［8］。配方中酪蛋白经EDTA-Na₂漂洗数次，以清除锌离子，配方不加入锌源为严重缺锌饲料，饲料含锌水平为1mg/kg，其它各组饲料按不同要求加入ZnCO₃使其分别达到5、30和100mg/kg。动物饲养在塑料笼具内，自由饮用双蒸水，照明时间为12h/d，室温为21～25℃。在实验仔鼠成年(70日龄)时，在穿梭箱内对其学习能力进行测试，然后剥离各实验组仔鼠脑组织，采用Western blot技术检测α-Tub、β-Tub及MAP2表达水平。

1.3学习能力检测

行为训练是在穿梭箱内进行^［9］。该装置有2个室：一个室内小鼠接受电击，另一个没有电击。一盏40W电灯作为刺激条件，在灯光刺激后的5秒给予电击(40V DC)，每1分钟测试1次。多次训练后小鼠能在灯光刺激后的5秒内跑到另一室以逃避电击为条件性回避反应。如果连续10次测试中出现9次条件性回避反应，就认为小鼠已经学会。实验结果均用±s表示，并采用方差分析进行统计学检验。

1.4Western blot检测^［1］

冰浴状态下取新鲜实验仔鼠组织，按照1∶2(W/V)加入组织提取液(EDTA 20mmol/L、EGTA 10mmol/L、PMSF 1mmol/L、urea 2mmol/L、 DTT 1mmol/L及蛋白抑制酶肽0.2μg/ml的TBS缓冲液pH7.6)，冰浴超声匀浆，15000r/min 4℃离心5min，取上清液用乙醇(70%乙醇，0.13mol/L醋酸钾)沉淀，用Lowry法测定总蛋白量。然后进行SDS-PAGE(8.5%T、2.6%C)分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭30min。第一抗体(抗α-Tub单克隆抗体、抗β-Tub单克隆抗体及抗MAP2单克隆抗体)500倍稀释于封闭液中，4℃反应过液。封闭液为含1%BSA及0.5%NGS的PBS溶液。将封闭液倒净，次日以漂洗缓冲液(PBS，含0.05% Tween-20及1%BSA)洗去第一抗体。第二抗体(AP-羊抗小鼠IgG)500倍稀释于封闭液中，室温反应1h后依次以漂洗缓冲液、PBS洗去多余二抗。避光显色(显色液为75kg/ml NBT,50mg/ml BCIP,0.1mol/L NaCl,0.5mol/L MgCl₂,0.1mol/L Tris-HCl,pH9.5)，待条带清晰出现后终止反应(终止反应缓冲液为20mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH7.9)。对各杂交条带密度进行扫描，比较其相对量。

2结果

2.1孕期及哺乳期锌缺乏对实验仔鼠学习能力的影响

由图1可见，严重缺锌组(SZD)及轻度缺锌组(MZD)仔鼠达到学会标准所需的次数(53.2±7.1，n=10；45.0±5.9，n=7)明显多于适锌组(ZA)、高锌对照组(PF)及高锌组(ZS)(39.9±4.3，n=10；36.4±3.5，n=10；34.7±3.9，n=11)，并具有统计学意义(P＜0.01)。结果表明，母鼠在孕期及哺乳期锌缺乏可使其仔鼠学习能力明显受损。

图1孕期及哺乳期锌缺乏对实验仔鼠学习能力的影响

2.2孕期及哺乳期锌缺乏对实验仔鼠脑组织α-Tub及β-Tub表达的影响

由图2可见，严重缺锌组(SZD)和轻度缺锌组(MZD)实验仔鼠脑组织α-Tub表达量仅为高锌组(ZS)的40.5%和49.5%；对于β-Tub，严重缺锌组(SZD)及轻度缺锌组(MZD)的表达量仅为高锌组(ZS)的29.8%和50.3%。各组仔鼠脑<