摘要：为了解降钙素(CT)对体外培养的人成骨样细胞OS-732增殖与细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)₂D₃的作用进行比较，在培养液中添加1IU/ml CT前后观察DNA合成速率、细胞增殖、细胞周期和细胞膜流动性的变化。结果表明CT有明显促进OS-732细胞增殖和DNA合成的作用，使G₂+M期细胞所占的百分比增加，而S期细胞的百分比下降。1，25(OH)₂D₃可使细胞膜流动性增加，而1IU/ml CT使其下降。结论认为降钙素与1，25(OH)₂D₃不同，它促进人成骨样细胞增殖和降低细胞膜流动性。

中图分类号：Q573Q593.6文献标识码：A

文章编号：1000-8020(2000)03-0168-02

Effect of calcitonin on the proliferation and membrane fluidity of

human osteoblast-like cells

Xue Yan, Yuan Runying, Xiang Dong, Wang Hongxia

(Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035,China)

Abstract：The effects of calcitonin (CT) on the proliferation and membrane fluidity of human osteoblast-like cells line OS-732 were compared with the effect of 1,25(OH)₂D₃. The rate of DNA synthesis, cell proliferation, cell cycle and membrane fluidity of OS-732 cells were observed. Results showed that 1IU/ml CT stimulated cell proliferation and DNA synthesis. The percentage of cell in the G₂+M phase was increased and the percentage of cell in the synthetic phase was decreased. The membrane fluidity of OS-732 cells was increased after 0.1μmol/L and 0.01μmol/L 1,25(OH)₂D₃ treatment and was decreased after 1IU/ml CT treatment. It is concluded that calcitonin might increase the cell proliferation and decrease the membrane fluidity.

Key words:calcitonin, OS-732 cell line, cell proliferation, cell cycle, membrane fluidity

降钙素(CT)和1，25双羟维生素D₃［1,25(OH)₂D₃］、甲状旁腺激素(PTH)是三大重要的钙调节激素^［1，2］，它们之间互相协调不仅维持了血钙的平衡，也保证了骨代谢的正常进行，使骨形成和骨吸收处于平衡状态。当这一平衡被破坏就会引起代谢性骨病的发生。

我所建立的人成骨肉瘤细胞系OS-732^［3］，已成为我们研究成骨样细胞特征的体外模型。本文观察了鲑鱼降钙素对人成骨样细胞OS-732细胞的增殖、细胞周期和细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)₂D₃进行比较。

1材料与方法

1.1试剂

1，25双羟维生素D₃［1，25(OH)₂D₃］由瑞士F.Hoffmann-La Roche公司提供。溶于无水乙醇，用培养液稀释成0.1和0.01μmol/L。

鲑鱼降钙素(calcitonin,CT)瑞士山德药厂产品，用培养液稀释成1IU/ml。

DPH(1，6-diphenyl-1,3,5-hexatriene,1,6,-二苯基-1,3,5,-已三烯)为美国Sigma公司产品，³H-TdR为中国原子能研究院产品，四氢呋喃为上海试剂厂产品。

1.2细胞培养与处理

将人成骨样细胞系OS-732接种于含20%小牛血清的RPMI-1640(Gibco)培养液的培养瓶内，在对数生长期换为含1IU/ml CT的培养液，对照组仅更换基础培养液，将细胞密度调至5×10⁴/ml，置于37℃，5%CO₂培养箱中，第2、4、6天进行细胞计数，绘制生长曲线，并计数抑制率和增长率。

1.3OS-732细胞DNA合成速率的测定

用培养液将细胞密度调至2.5×10⁴/ml，将细胞悬液加入96孔培养板，每孔再加入³H-TdR 1000Bq，按纸片法进行³H-TdR参入实验，用液闪仪计数。

1.4细胞周期分析

各实验组及对照组细胞在培养到第2、4、6天后离心收获，用70%冷乙醇固定24小时后用PBS清洗除去乙醇，用RNase(0.5mg/管)37℃消化30min，冷却，PI染色15min，用美国B-D公司FACS-440型流式细胞仪(激发光488nm，发射光585nm)以鸡血细胞为内参对照，测定DNA含量(CV值＜7%)。根据DNA分布的直方图，用多项式拟合法计数细胞周期各时相的百分比。

1.5细胞膜脂的荧光标记及膜流动性的计算

DPH标记过程按文献进行^［4］。将DPH溶于四氢呋喃，配成20mmol/L的储存液，用0.15mol/L PBS(pH7.5)稀释成2μ mol/L的应用液。用DPH应用液将细胞密度调至7×10⁵/ml，37℃孵育30min。标记后的细胞用PBS洗涤并配成细胞悬液。用日立MPF-4型荧光分光光度计(激发波长为362nm，发射波长为432nm)，测定荧光偏振值(P)。

P_r和P_max分别代表P的测量值和理论极限值(P_max=0.5)

1.6统计学处理

用t检验进行统计学处理。

2结果

2.1细胞生长曲线

1 IU/ml CT组和对照组细胞生长曲线表明：在给药后第2、4、6天CT对细胞增殖有促进作用(图1)。

图1细胞生长曲线

2.2DNA合成速率

OS-732细胞在用1 IU/ml CT处理后第2和第6天，³H-TdR参入量分别为13650和11326cpm，对照组分别为9373和7593cpm，表明1 IU/ml CT对OS-732细胞DNA合成有促进作用。

2.3细胞周期

在药物处理后第2、4、6天用流式细胞仪分别测定对照组和实验组的OS-732细胞DNA含量。按拟合曲线程序计算出各时相细胞百分数。

附表为用1IU/ml CT处理后第2、4、6天细胞周期各时相细胞百分比。在给CT后的第2、4、6天，G₀+G₁期细胞比率增加，S期细胞比率下降。G₂+M期在给CT后第2和4天细胞比率均增加，而第6天下降。

2.4细胞膜流动性

OS-732细胞膜流动度(LFU)在0.01 μmol/L 1，25(OH)₂D₃处理后第2天和第4天均高于对照组(图2a)。

OS-732细胞膜流动度在1 IU/ml CT处理后第2、4、6天，均低于对照组(图2b)。

图2细胞膜流动性

3讨论

1，25(OH)₂D₃对骨代谢和血钙浓度具有双向调节作用，既能促进骨吸收，又能促进骨形成。体外实验表明1，25(OH)₂D₃对不同来源和不同成熟阶段的细胞增殖均有抑制作用^［5］。并参与调节成骨细胞(OB)的生理功能。1，25(OH)₂D₃促进OB分泌骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙素和IGF-1；抑制OB分泌Ⅰ型胶原并调节ALP的活性。而降钙素的主要生理功能是降低血钙，抑制破骨细胞(OC)活性和骨吸收。

本文以细胞生长曲线和³H TdR参入实验作为细胞增殖指标，观察CT对人成骨样细胞系OS-732增殖的影响。发现1 IU/ml CT可促进OS-732细胞增殖，对DNA合成也有促进作用。CT对OS-732细胞增殖的作用与1，25(OH)₂D₃相反，说明CT与1，25(OH)₂D₃对成骨样细胞有不同的调节作用。

细胞周期各时相的百分比反映了细胞增殖状态。我们曾报道1，25(OH)₂D₃处理第4天，大多数细胞进入G₀期，2C细胞增加^［5］。G₀+G₁百分比增高，S期百分比下降，细胞被阻断在G₀+G₁期。S期细胞百分比下降，G₂+M期无改变。而1IU/ml CT处理后第4天，S期细胞百分比下降，而G₂+M期上升，表明1IU/ml CT有促进4C细胞增殖的作用。

细胞膜在细胞代谢、分裂、增殖中起重要作用。细胞膜上蛋白质和脂类具有传递胞外各种信息的作用。细胞膜区的流动性反映分子在双层脂层三维空间中的运动。细胞膜的流动性与细胞的通透性、信号传递、膜上酶的活性激素受体功能等有密切关系^［6］。膜流动性的下降使这些功能特征下降和损伤；膜流动性上升，使这些功能被激活。1，25(OH)₂D₃增加OS-732细胞膜的流动性，Robey等报道