摘要：应用血浆Percoll梯度分离技术分离健康供血者的中性粒细胞(PMN)并以2×10⁷ PMN／ml培养24h，实验分白细胞介素6(IL-6)、血小板活化因子(PAF)单独处理组。PAF受体拮抗剂BN52021预处理后再以PAF、IL-6分别处理组。吖啶橙和溴乙啶染色，荧光显微镜下观察细胞形态并记数进行细胞凋亡的定性定量分析。结果表明，IL-6和PAF均有抑制PMN凋亡的作用。PAF受体拮抗剂BN52021能消除IL-6和PAF抑制PMN凋亡的作用。提示IL-6抑制PMN凋亡的机制可能是通过PAF而实现的。从而从一个侧面说明了IL-6和PAF介导的损伤后炎症反应及继发性器官功能衰竭可能与抑制中性粒细胞凋亡加剧炎症反应有关。

中图分类号：Q593Q255文献标识码：A

文章编号：1000-8020(2000)03-0131-03

Role of interleukin-6 and platelet-activating factor

in delaying neutrophil apoptosis

Guan Zengwei, Li Yong, Wang Shenglan, Yang Jianru, et al.

(Department of Cell Analysis, Medical Analysis Center of Beijing Medical University, Beijing 100083,China)

Abstract：In the present study we investigated the role of platelet-activating factor (PAF) and interleukin-6 (IL-6) in delaying polymorphonuclear neutrophil (PMN) apoptosis. Isolation of PMN was performed by using the discontinuous plasma-Percoll gradient technique. PMN was cultured in enriched RPMI 1640 media at 2×10⁷ PMN／ml for 24h. Subgroups were treated with IL-6 or PAF or pretreated with PAF receptor antagonist BN52021 before IL-6 or PAF were added. Morphological assessment and quantitation of apoptosis were performed with acrodine／ethidium bromide stain and epifluorescent microscope. The results showed that both IL-6 and PAF suppressed PMN apoptosis. Pretreatment of PMN with BN52021 abrogated the effects of IL-6 and PAF. It is suggested that PAF may be a crucial cytokine in the suppression of PMN apoptosis. These observations may contribute to elucidating the mechanisms of IL-6 and PAF in mediating postinjury hyperinflammation and secondary organ dysfunction and provide a clue for the prevention and treatment of the conditions.

Key words:interleukin-6, platelet-activating factor, antagonist,polymorphonuclear neutrophil, injury, inflammation

机体在损伤和感染的急性期，血循环中白细胞介素6(IL-6)水平往往升高^［1］。研究表明，IL-6水平过高或持续时间太长则会对机体造成有害影响，如：创伤、烧伤、严重感染等并发的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和／或多器官功能衰竭等都与血液中IL-6水平持续升高有关^［2］。越来越多的证据表明IL-6是一种促进炎症反应的活性介质，其机理可能是调节成熟中性粒细胞(PMN)的功能。有研究表明，IL-6能够促进PMN的氧化反应，延缓PMN的凋亡^［3］，从而使PMN在循环中及炎症部位增多，在活化时释放超氧阴离子(O^-₂)增多^［4］。由此可见，IL-6能增强PMN的细胞毒性，从而加剧炎症反应。此外，研究发现，有一种内源性脂质介质血小板活化因子(PAF)与损伤后炎症反应密切相关^［5］，PAF促进炎症反应的作用表现在它能使PMN致敏，促进PMN与细胞的粘附。新近的研究发现IL-6能刺激PMN产生PAF^［6］。本文旨在探讨PAF和IL-6对PMN凋亡的抑制作用。

1材料与方法

1.1材料

IL-6由北京医科大学免疫学系分子免疫室马大龙教授提供，PAF(1-0-heodelyl-2-edcetyl-glycero-sn-3-phos-phocholine,Sigma),用含有0.25%小牛血清生理盐水(0.25% BSA)配置为10mg/L浓度，在-20℃保存，PAF受体拮抗剂，BN52021由法国IPSEN公司IHB研究所Pierre Braquet教授提供，RPMI-1640(Sigma)。

1.2方法

中性粒细胞系用血浆-Percoll梯度分离法^［7］，取正常健康人静脉血，用3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1)，1 500转离心10分钟，取血浆进一步离心制备贫血小板血浆(PPP)。血细胞部分中加入6%葡聚糖，沉降30分钟后，吸取无红细胞的上层液，用0.9%生理盐水洗涤2次后，将细胞悬浮于2ml PPP中，然后加入2ml 42%和51%的Percoll并离心，收集42%到51% percoll界面间的PMN，然后用0.9%生理盐水洗涤2次，以含10%热灭活小牛血清，青霉素100U／ml、链霉素100 U／ml的RPMI1640培养液悬浮细胞，使其浓度为2×10⁷／ml(PMN≥95%)。应用苔盼蓝排斥试验检测，活细胞≥98%，在37℃、含5%CO₂饱和湿度条件下孵育24小时。每一组设3个平行样，IL-6的浓度分别为0.1、1.0、10.0μg/L，PAF浓度也分别为0.1、1.0、10.0μg/L，PAF受体拮抗剂BN52021终浓度为2.7×10^-3mol/L，BN52021比PAF及IL-6提前30分钟加入细胞悬液，在37℃条件下孵育。

1.3凋亡的检测

PMN培养24小时后，用落射荧光显微镜观察细胞形态以区别凋亡。吖啶橙(acridine orange,Sigma)和溴乙啶(ethidium bromide，Sigma)均用生理盐水配置为100mg/L浓度，吖啶橙用于核形态观察，以识别凋亡，溴乙啶用于检测细胞活性。取25μl细胞悬液加5μl染液染色10min，置玻片上，在落射荧光显微镜下观察，每个样品至少计数100个细胞。用无凋亡核形态的活细胞数除以观察的总细胞数，求得活细胞百分比。

1.4统计处理

应用SAS统计软件行方差分析(ANOVA)处理数据，比较各实验组与对照组，确定结果差异的显著性。

2结果

PMN培养24小时后，对照组生存率为(28±3)%；实验组用IL-6以0.1、1.0、10.0μg/L孵育同样时间后，PMN生存率与对照组相比均有显著性提高，3种不同的剂量处理后，分别为(42±4)%(F=36.16,P＜0.01)，(50±8)%(F=20.45，P＜0.01)，(54±4)%(F=81.05，P＜0.01)。用PAF以0.1、1.0、10.0μg/L浓度孵育24小时，PMN生存率与对照组相比均有显著性差异，分别为(46±6)%(F=29.90，P＜0.01)，(51±7)%(F=28.55，P＜0.01)，(62±6)%(F=114.24,P＜0.01)，图1。此外，应用PAF受体拮抗剂BN52021单独作用或者与PAF、IL-6分别共同孵育后，可见BN52021单独作用时，PMN生存率为(31±6)%，与对照相比，无明显差异(F=2.53，P＞0.05)，而用BN52021预处理后，无论是PAF还是IL-6都失去了延缓PMN凋亡的作用。与未经BN52021预处理组相比，PAF+BN52021处理组，PMN生存率为(34±4)%(F=8.64，P＜0.05)，IL-6+BN52021处理组PMN存活率为(37±5)%(F=11.89,P＜0.05)，图2。

图1IL-6和PAF对PMN存活的影响

图2PAF拮抗剂BN52021消除

IL-6和PAF抑制PMN凋亡的作用

3讨论

近年来，研究表明血循环中IL-6水平过高或作用时间过长会对机体产生不良影响，如：创伤、烧伤、感染患者的呼吸窘迫综合症，多发性器官功能衰竭等都与IL-6有关^［2］，研究认为，IL-6能调节PMN的功能，促进PMN的氧化，延缓PMN的凋亡，从而使PMN数量增多，因此，在活化时释放的能力增强^［4］。此外，IL-6还能促使内皮细胞表达细胞间粘附分子(ICAM-1)增多，从而进一步促进PMN与内皮细胞的粘附，IL-6还能提高内皮细胞的通透性，因此，IL-6对炎症性器官损伤具有重要作用^［8］。

PAF是体内多种组织细胞在致炎因子等刺激下合成释放的一种具有广泛生物学作用的磷脂介质，从病理生理的角度看，PAF主要是诱导血小板聚集及脱颗粒，促进白细胞的化学趋化、粘附及聚集，增强巨噬细胞的吞噬功能，引起平滑肌的收缩，调节神经功能等。在临床上，损伤后PAF水平并无显著增高，但在损伤后出现剧烈炎症反应时确有PAF水平的升高，有证据表明PAF与损伤后剧烈炎症反应有关。PAF的促炎作用主要是使PMN致敏，增强PMN与内皮细胞的粘附。研究表明，PAF也可作为PMN细胞内第二信使发挥功能^［9］。Walter等发现IL-6能刺激PMN生成PAF^［10］。本研究发现应用IL-6或PAF单独处理后，PMN的存活率都明显提高，而在IL-6或PAF处理前，用PAF拮抗剂BN52021预先处理后，可见PMN的存活率又降到与对照组相似水平。实验证实，IL-6和PAF都具有延缓PMN凋亡的作用，由于PAF拮抗剂BN52021对IL-6和PAF所致的PMN存活率提高都有抑制作用，因此，推测IL-6延缓PMN的凋亡是通过PAF而实现的。

PMN凋亡对炎症反应的消退具有重要意义^［11］，凋亡的PMN被巨噬细胞吞噬而不引起炎症反应或细胞毒性作用^［12］，在病理状态下，PMN凋亡抑制<