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分类号：Q591.5Q949.777.7文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0115-03
Isolation and purification of lycium barbarum
polysaccharides and its antifatigue effect
Luo QiongYan JunZhang Shenghua
（Department of Hygiene，Hubei Medical University，Wuhan430071，China）
Abstract：A purified component of lycium barbarum polysaccharide (LBP-X) was isolated from lycium barbarum L. by DEAE ion-exchange cellulose and sephacryl gel chromatography. LBP-X was tested on five different doses (5，10，20，50 and 100 mg·kg-1.d-1) in mice. The results showed that LBP-X induced a remarkable adaptability to exercise load， enhanced resistance and accelerated elimination of fatigue. LBP-X could enhance the storage of muscle and liver glycogen， increase the activity of LDH before and after swimming，decrease the increase of blood urea nitrogen (BUN) after strenuous exercise，and accelerate the clearance of BUN after exercise. The dosage of LBP-X 10 mg·kg-1.d-1 was the best amount among the five tested doses.
Keywords：purified lycium barbarum polysaccharide，antifatigue
近代医学及药理学研究证明，枸杞有免疫促进作用，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides， LBP)是枸杞促进免疫功能的有效成份［1，2］。由于多糖的结构复杂，纯化提取难度大，多数试验均用粗品。为进一步探讨祖国传统医学对枸杞及其多糖的临床使用价值，本研究采用萃取、离子交换层析、凝胶层析等方法，从宁夏枸杞果实中获得枸杞多糖纯化组分(LBP-X)，以5个不同剂量灌胃小鼠，观察LBP-X对小鼠抗疲劳作用的影响及其量效关系。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1枸杞子枸杞子(lycium barbarum L， LBL)为宁夏中宁县产品。
1.1.2仪器岛津UV-265FW紫外可见分光光度计；日立260-10型红外光谱仪；5890Gas Chomatograph 5971 Mass Specdetector气质联用仪；LKB 2137自动柱层析系统；LKB-4400氨基酸自动分析仪。
1.1.3试剂Sephacryl S-300为Pharmacia产品；D-半乳糖醛酸(AR)为Sigma公司产品；DEAE纤维素为上海试剂二厂产品；各种单糖均为Sigma公司产品。
1.1.4动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(32±2)g，由湖北省医学科学院动物室提供。合格证号：医动字第19007。
1.2方法
1.2.1枸杞多糖的分离纯化［3，4］提取、分离：
枸杞子60℃烘干氯仿—甲醇2∶1脱脂80%乙醇脱低聚糖→水提取→浓缩→乙醇沉淀→脱水→真空干燥→粗品LBPDEAE纤维素(OH-)柱分级→浓缩葡聚糖凝胶G-25脱盐→浓缩→冷冻干燥→纯化枸杞多糖(LBP-X)。
枸杞子经脱脂、脱糖及90℃左右水提取3次，合并滤液并浓缩。以5倍体积的95%(V/V)的乙醇沉淀2次，抽滤(或离心)，95%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得粗品LBP。粗品LBP上DEAE纤维柱(OH-型，2.6×90cm)，用水充分洗脱，然后分别以0.05、0.1、0.5mol/L NaCl各480ml进行洗脱，同时以每管15ml收集，苯酚法显色。经透析、浓缩、冷冻干燥分别得LBP4个级分的半纯品。将半纯品20mg溶于3ml水中，加样于Sephacryl S-300柱(1.6×48cm)上，以重蒸水洗脱，流速20ml/h，以每管3ml收集，苯酚法显色；浓缩、冷冻干燥后合并得到对应的4个级分的纯化枸杞多糖15mg。从4个级分中筛选出其获得量相对较多、动物预实验效果相对最好的一个级分(LBP-X)，进行理化分析及抗疲劳实验。
纯度鉴定：凝胶层析，以0.5ml水溶解1.0mg样品，上已平衡好的Sephacryl S-300柱(1.6×48cm)，以0.2mol/L NaCl洗脱，流速10ml/h。以每管1ml收集，苯酚法显色。离子交换柱层析：采用DEAE纤维素柱(B4O2－7型，1.1×40cm)，以0.5mol/L硼砂同上进行洗脱、收集、显色。
GC/MS对糖组成的分析：LBP-X在30g/kg H2SO4溶液中经120℃、103kPa水解1h，BaCO3中和，制备成糖醇乙酸酯衍生物，按Varma方法进行GC/MS分析［5］。分析柱为OV-225FSOT毛细管柱(15cm×0.52mm)，程序升温170～200℃。
半乳糖醛酸(GalA)的定性定量分析：显色反应，LBP-X的硫酸-半胱氨酸反应呈蓝绿色，为GalA的特征反应。含量测定：采用咔唑法显色，在530nm处比色测定。
氨基酸自动分析：LBP-X 1mg溶于6 mol/L的HCl溶液1.5ml中，封管后110℃水解24h，切开封管，抽干，进行氨基酸分析。
红外光谱鉴定：KBr压片。
紫外光谱扫描：用0.05%多糖水溶液。
1.2.2动物分组及处理180只小鼠随机分为正常对照组(F)和5个不同剂量的实验组，每组30只。LBP-X分别以5、10、20、50及100mg*kg-1*d-1剂量用生理盐水稀释后按25ml/kg*BW灌胃，正常对照组按等量生理盐水灌胃，连续10天。
1.2.3疲劳模型的制备［6］末次灌胃后，采取负重(体重的4%)在(30±2)℃水中游泳40min的方法造成疲劳。用60cm×40cm×50cm的水槽多个同时使用，水深30cm。在运动前静息时及游泳停止后90min、150min分别采血。
1.2.4测定指标［7］用蒽酮比色法测肌糖原(MC)、肝糖原(LC)含量；King氏法测定血液乳酸脱氢酶(LDH)总活力；二乙酰乙肟—硫氨脲比色法测定血尿素氮(BUN)。
2结果
2.1枸杞多糖的理化性质
2.1.1枸杞多糖的糖组成结果表明(图1)，LBP-X中单糖主要由阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)及葡萄糖(Glc)组成；其单糖组成摩尔比为Rha∶Gal∶Glc∶Ara∶Man∶Xyl=4.22∶2.43∶1.38∶1.00∶0.95∶0.38；总糖含量为83.99%。
图1LBP-X中单糖的气-质谱分析
2.1.2半乳糖醛酸及氨基酸含量根据标准系列的回归方程(ABS=0.01550CONC-0.007785，r=0.9998)求得LBP-X的GalA含量为33.33%［4］。枸杞多糖中测得17种氨基酸的含量，总量为8.46%。
2.1.3红外及紫外光谱红外光谱结果见图2。图谱显示LBP-X具有多糖的特征吸收峰，890cm-1是β-吡喃糖苷链的特征吸收峰［8］，紫外光谱在204.4nm处有最大吸收峰。
图2枸杞多糖的红外光谱分析
2.2LBP-X对小鼠肌糖原、肝糖原含量的影响
2.2.1LBP-X增加肌、肝糖原的量效关系实验10天后每组取10只小鼠断头处死，立即取后肢肌肉和肝脏各1g(湿重)，用蒽酮比色法测定运动前糖原的含量。
由表1可见，LBP-X各剂量组的肌糖原、肝糖原含量明显高于对照组(P＜0.01)，说明LBP-X能增加肌糖原、肝糖原在肌体中的储备，以B组效果最佳。
2.2.2LBP-X增加肌、肝糖原储备量的时效关系各组的另20只小鼠放在水箱中游泳40min，分别于游泳后90min及150min两个不同时间点断头处死10只小鼠，测定糖原含量。表1显示各LBP-X组运动后肌糖原及肝糖原含量明显高于对照组。
2.3LBP-X提高小鼠血液LDH活力的量效关系
处死前自小鼠股动脉放血，测LDH活力。表2表明，各组游泳前LDH活力较对照组明显提高，尤以B组显著，游泳后90min LDH活力进一步提高，游泳后150min活力虽已下降，但与对照组之间的差异仍然存在，其结果与90min一致。
2.4LBP-X对小鼠血尿素氮含量的<
