摘要：应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16及化学毒物叠氮钠分别诱导HL-60细胞凋亡及坏死，在0、2、4、8、16及24h各时间点，应用Hoechst33258染色，荧光显微镜及透射电镜对核形态进行观察，通过流式细胞术检测二乙酸荧光素(FDA)、罗丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(PI)荧光强度的变化，观察细胞凋亡及坏死过程中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。结果显示：HL-60细胞在VP-16处理4h时核形态开始变化，有核浓缩的细胞比例在8h达高峰，然后下降；核碎裂细胞的比例在24h达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。线粒体跨膜电位在8h后渐渐降低，16h可见明显降低。坏死细胞的线粒体膜电位在4h降低50%，细胞膜通透性也在8h之后出现变化。随处理的时间延长，FDA荧光强度进一步降低，对PI的摄取渐渐升高。结果提示，细胞凋亡过程中细胞膜通透性逐渐增高，线粒体膜电位降低。这两个指标能反映细胞凋亡及其程度，结合对细胞核形态观察，能更准确、可靠地反映细胞凋亡的发展变化。

分类号：Q244Q558文献标识码：A

文章编号：1000-8020(2000)02-0083-04

Kinetics of plasma membrane and mitochondrial alterations

in HL-60 cells undergoing apoptosis

Guan ZengweiWang ShenglanLi YongYang Yepeng，et al.

（Medical and Pharmaceutical Analysis Center，Beijing Medical University，Beijing100083，China）

Abstract：In the present study，VP16，an inhibitor of topoisomerase Ⅱ，and NaN₃，a chemical toxic substance，were used to induce apoptosis and necrosis of HL-60 cells，respectively. Cells were examined by transmission electron microscopy and by fluorecence micrscopy after staining with Hoechst 33258 at 0，2，4，8，16 and 24h of culture. Alterations of fluorescent intensity produced by FDA，Rh 123 and PI were measured by flow cytometry，which reflects sequential changes on plasma membrane permeability and the potential of mitochondrial membrane. The results indicated that the nuclear morphologic alteration of cells treated with VP-16 began at 4 hour of culture and the cells with condensed nucleus culminated at 8h of culture and then reduced with no drop in cell counts，while the percentage of cells with fragmented nuclei reached its maximum at 24h of culture accounting for some 80%. The potential of mitochondrial membrane of of apopototic cells decreased gradually from 8h of culture and showed obvious decline at 16h of culture.In necrotic cells，the potential decreased by 50% at 4h of culture which indicates an earlier and more rapid decline than that in apopototic cells. Alteration of plasma membrane permeability appeared at 8h of culture and showed a steady increase over time. It was concluded that plasma membrane permeability and mitochondrial membrane potential could reflect the development and degree of apoptosis，and the combination of these two criteria with nuclear morphology revealed by staining with Hoechst 33258 would be a simple and reliable assay for apoptosis and its progression.

Key words：apoptosis，flow cytometry

细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义^［1］。

细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作用、严重缺氧、高温、某些病毒感染及多种化学毒物损伤都可造成细胞坏死。坏死时，细胞膜、核膜常破损，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集^［2］。根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。本文应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16和叠氮钠分别诱导HL-60细胞的凋亡及坏死，在透射电镜和荧光显微镜下观察形态变化，流式细胞术检测FDA、PI及罗丹明123荧光强度的动态变化，以探讨细胞凋亡和坏死时在流式细胞术检测中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。

1材料和方法

1.1细胞培养

人早幼粒细胞白血病细胞株HL－60细胞由北京医科大学天然药物国家重点实验室提供，本室传代培养。取0.2×10⁶/ml细胞接种于含10%热灭活小牛血清(北京北效农场产品)及100 U/ml青霉毒、100U/ml链霉素的RPMI 1640(Gibco)培养液中，在37℃、含5%CO₂的饱和湿度孵育箱中培养。

1.2细胞凋亡及坏死的诱导

VP－16(连云港制药厂产品950259)在实验前用乙醇新鲜配制成200mmol/L，终浓度为0.6mmol/L，NaN₃用蒸馏水制成3mol/L，室温保存，终浓度为30mmol/L。将对数增长期的细胞离心后换液，同时加上述药物处理，在不同作用时间点收集细胞进行形态学观察和流式细胞术检测。

1.3透射电镜观察

取20×10⁶个培养细胞，用1%戊二醛迅速原位固定30min，置细胞于离心管中，低速离心后向沉淀中加入1.5%戊二醛继续固定1h，用0.18mol/L蔗糖冲洗液冲洗3次，每次1h，并在冲洗液中过夜，用1%琼脂包埋沉淀的细胞，用1%锇酸后固定2h，冲洗后，用丙酮梯度系列脱水；以100%丙酮与包埋剂(1∶1)混合物37℃浸透3h，Epon 812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，H-500电镜下观察、拍照。

1.4荧光显微镜观察

Hoechst 33258(Sigma)用蒸馏水配制成1mg/ml，细胞培养液的终浓度为10μg/ml，在37℃下染色30min后，用多聚甲醛固定，将细胞沉淀物涂于玻片上，用指甲油封片进行观察。此外，用Hoechst 33258(1μg/ml)染色7min，用PBS洗涤，然后用PI 5μg/ml再染5min，立即在玻片上观察，分别计数PI⁺细胞中核形态正常、核浓缩或核碎裂的细胞。

1.5流式细胞术检测

荧光染料PI(Sigma)(最大激发光波长540nm，发射光波长625nm)用PBS配制为100μg/ml，4℃避光保存，按5μg/ml终浓度染色，立即用流式细胞术检测，FDA(最大激发光波长494nm，发射光波长517nm)(Sigma)用丙酮新鲜配制为2mg/ml贮备液，按1×10⁶/ml细胞加125μl，使终浓度为0.25mg/ml，孵育5min后，用流式细胞术检测，Rh123(最大激发光波长505nm，发射光波长334nm)(Sigma)用蒸馏水配为1mg/ml贮备液。按1×10⁶/ml细胞加10μl，使终浓度为10μg/ml，37℃孵育30min，然后用PBS洗2次，在流式细胞仪上检测荧光强度。

流式细胞术(FACScan flow cytometry)(Becton Dickinson)系用氩离子激光激发光源，功率15mW，发射光488nm，FDA、Rh123的绿色荧光用530／30nm带通滤片收集，PI发出的红色荧光用585／42nm带通滤片收集，分析细胞数为10 000，荧光强度以对数模式测定。PI染色时，当荧光强度大于对照细胞时认为是PI⁺，FDA及Rh123染色时，当荧光强度低于对照细胞时，认为染色为阴性，应用Lysys Ⅱ软件(Becton Dickinson)收集、储存、处理数据。

2结果

2.1凋亡细胞的形态变化

培养细胞在凋亡诱导处理的0、4、16小时进行电镜和荧光显微镜观察，与对照(图1A)相比，用VP－16处理后，可见典型的凋亡细胞形态特征，表现为核浓缩或染色质边集，或有核碎裂，但细胞膜、核膜及线粒体形态保持完整(图1B)。NaN₃处理细胞的细胞膜及核膜完整性破坏，细胞浆降解，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集(图1C)。在培养的0、2、4、8、16、24小时，用Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态，可见正常细胞核边界规则整齐(图1D)，用VP－16处理后，可见细胞核碎裂(图1E)或浓缩(图1F)，NaN₃处理后，可见核形态弥散且不规整(图1G)。

未经处理(0小时)时，85%～90%的细胞核规整且呈圆形，5%有核碎裂，4%～9%有核浓缩，1%细胞核呈不规则形状，对照组在整个培养过程中，各种核形态所占百分比的变化不大。用VP－16或NaN₃处理4小时后，核形态比例开始变化，在处理8小时有核浓缩的细胞比例达高峰，然后下降，而核碎裂细胞的比例在24小时达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。在整个培养过程中，VP－16处理者，具有坏死细胞核形态特点的细胞＜8%，而用NaN₃处理后的细胞，坏死细胞的比例在2～24小时渐渐从5%升高到97%。核碎裂及核浓缩细胞的比例超过对照组(图2)。

2.2线粒体跨