摘要应用体内、体外微核分析和单细胞凝胶电泳技术(慧星分析，comet分析)探讨氯化饮水的有机提取物对人肝肿瘤细胞(HepG2)和大鼠肝细胞、骨髓嗜多染红细胞(PCEs)的遗传损伤作用，并观察其对大鼠组织脂质过氧化作用(LPO)的影响。结果表明，氯化饮水低浓度提取物能诱导大鼠PCEs微核的增加，而高浓度提取物则能增加HepG2微核的发生率。comet分析表明，氯化饮水的提取物可引起大鼠肝脏细胞和HepG2的DNA断裂。丙二醛的含量在所有的受试动物和受试器官中均有明显增加，在肝脏丙二醛含量随着剂量的增加而增加。提示氯化饮水中有机提取物对哺乳动物细胞具有遗传毒性作用和氧化损伤作用。

分类号R123.5R994.6

Genotoxicity and lipid peroxidation caused by organic extracts of chlorinated drinking water in rats and HepG2 cells

Lu Wenqing, Yue Fei, Chen Xiuna, Li Xiaoyan, et al.

（Tongji Medical University, Wuhan 430030，China）

Volker Mersch-SundermannCornelia Jenter

（Department of Environmental Health）

The genotoxic effects of chlorinated drinking water(CDW) extracts were examined in human HepG2 hepatoma cells, liver cells and polychromatic erythrocytes (PCEs) of bone marrow of Wistar rats by using in vivo and in vitro micronucleus(MN) test and single cell gel electrophoresis(comet assay). The influence of CDW on the lipidperoxidation (LPO) in blood and tissue of rats was also studied. The results indicated a significant increase of the frequencies of MN in PCEs at the low concentration of CDW and in HepG2 at the high concentration of CDW. The increased DNA breakage caused by CDW was observed in rat liver cells and in HepG2 cells by using comet assay. The levels of malon dialdehyde(MDA) were significantly increased almost in all animals and in all organs tested. A dose-dependent increases of MDA were observed in rat liver. It was demonstrated that CDW extracts caused genotoxic and oxidative damage on animals.

Key words:chlorinated drinking water, micronucleus, comet assay, HepG2,lipidperoxidation

氯化消毒是城市饮水消毒常用的标准方法，然而氯化水中的有机物反应可生成一系列氯化副产物。许多研究表明，某些氯化副产物能诱发细菌突变，对哺乳动物有遗传毒性作用；流行病学调查表明，饮水氯化与人类某些癌症的发病率增加有关。D湖是武汉市重要的饮用水水源，自六十年代起，D湖就因为严重的有机物污染而变为“富营养化”湖。已有研究表明，D湖湖水及其氯化自来水的提取物具有致突变性^［1］，饮用D湖自来水人群的肝、胃和肠癌死亡率明显高于对照人群^［2］。本文研究了D湖氯化饮水提取物诱发体内和体外DNA损伤的毒性作用以及对脂质过氧化作用的影响，以期进一步探讨氯化饮水提取物的遗传损伤作用和可能的肿瘤诱导作用。

1材料和方法

1.1样品的采集

夏季采集武汉市以D湖为水源的氯化饮用水(CDW)，以XAD2树脂吸附，丙酮洗脱。洗脱液浓缩至干燥，以50LCDW提取的浓缩干物溶于2ml DMSO作为样品储备液，保存于-20℃备用。

1.2微核分析

体内微核分析将体重为180～300g的雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组8只，将CDW样品储 备液用植物油稀释成不同浓度，每天给3个实验组(A、B、C)组大鼠不同浓度的CDW提取液(相当于CDW33.3、333.3、3333ml/kgBW)，以植物油和环磷酰胺(30mg/kgBW)分别处理阴性对照(NC)和阳性对照(CP)大鼠，实验期为14天，每天灌胃1次。于最后一次染毒24h后处死大鼠，取新鲜胸骨骨髓涂片，染色^［3］，于显微镜下每组计数4000个骨髓嗜多染红细胞(PCEs)中的平均微核发生率。

1.2.2体外微核分析^［4］用不同浓度的CDW提取液(A、B、C、D)处理人肝肿瘤细胞(HepG2，维也纳大学Knasmuller教授提供)，相当于CDW 0.167、1. 67、16.7、167ml/ml培养液，阴性对照(NC)为DMSO，阳性对照苯并(a)芘为［B(a)b］1.6 μmol/L，培养28h，用细胞松弛素处理后，胰酶消化，收获细胞，制片，染色，显微镜下每浓度组计数1000个双核肝细胞(BNC)中的微核发生率。

1.3comet分析^［5］

1.3.1HepG2 comet分析用CDW提取液处理HepG2细胞，浓度同上，阴性对照为DMSO，阳性对照为苯并(a)芘1.2μmol/L，经24h培养后，取1×10⁵个细胞和0.7%的低熔点琼脂糖(LMPA)100μl混合，浇注到全磨砂载玻片上(预先浇注有2层1%和0.5%的LMPA以改善琼脂糖的粘附)，制成微凝胶片，消化细胞，于碱性缓冲液中4℃条件下电泳(25V，300mA,25min),EB染色，荧光显微镜下用CCD光学图象分析系统对每个浓度组分析102个随机选择的细胞核，计算彗星“尾相”(彗星尾DNA含量×尾长)。

1.3.2大鼠肝细胞comet分析取健康初成年Wistar大鼠，断头处死后迅速分离肝组织，取1g组织剪成碎片，用2.5%的胰酶消化，800r/min离心10min，将细胞沉渣制成悬液，使细胞终浓度为2×10⁵个／ml。向细胞悬液A、B、C中加入不同浓度的CDW提取液，使CDW达500、1000、1500 ml/L培养液，阴性对照(NC)为DMSO，阳性对照为环磷酰胺丝裂霉素(MMC)20 mg/L，37℃培养2h。然后制成微凝胶片，电泳，吖啶橙染色，于荧光显微镜下对每个浓度组计数200个细胞核，计算尾长。

1.4脂质过氧化

大鼠用CDW提取液染毒14天后取血清、肝脏、肾脏和睾丸，组织用0.15mmol／L的冷氯化钾制成10%的匀浆，丙二醛的定量分析采用改良的硫代巴比妥酸(TBA)法^［6］。

2结果

2.1CDW对PCEs和HepG2的微核(MN)的诱导

用CDW提取液染毒14天大鼠的PCEs微核率增加，低浓度组(A)即显著高于对照组(NC)的微核率(P＜0.05)，在较高的CDW提取液染毒组(B和C组)未见PCEs微核率的进一步明显增加(图1)。

图1氯化饮水(CDW)提取物对大鼠PCEs微核的诱导

在HepG2体外微核试验中，较高的CDW提取液(C和D组)可引起HepG2微核率的明显增加(P＜0.01)，接近阳性对照组Bap(图2、图3)。

图2氯化饮水(CDW)提取物对HepG2微核的诱导

图3氯化饮水提取物对HepG2微核的诱导(箭头所示为微核)

2.2CDW对HepG2和大鼠肝细胞的comet分析

对HepG2的comet分析表明，与对照组(NC)尾相相比，高浓度CDW提取液(A)可产生较高的尾相(图4、图5)。

A：阴性对照DMSOB：CDW 167ml/ml培养 液

C：阳性对照苯并(a)芘(1.2 μmol/L培养液)

尾相：慧星尾DNA含量×尾长

4氯化饮水(CDW)提取物对HepG2的comet分析

图5氯化饮水提取物对HepG2 DNA损伤的彗星图

对大鼠肝细胞的comet分析表明，高浓度的CDW提取液(B及C组)可以导致肝脏细胞尾长增加，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)(图6)。

CDW浓度(ml/L培养液)

MMC：阳性对照丝裂霉素C(20mg/L培养液)

6氯化饮水(CDW)提取物对大鼠肝细胞的comet分析

2.3CDW对大鼠血清和组织LPO的影响

丙二醛作为脂质过氧化的产物，几乎在CDW提取液染毒的所有浓度组(A、B、C)和所有受试器官(肝脏，肾脏，睾丸，血清)中均明显升高，仅仅在低浓度组(A)大鼠的血清中没观察到脂质过氧化的诱导，尤其在肝脏，丙二醛的含量随着CDW提取液浓度的增加而明显增加(图7)。