摘要作者用一组体外短期检测试验，检验了茶色素在肿瘤的起动、促进、增殖阶段的作用并与茶多酚进行比较。选用基因正向突变和周期阻断法微核实验作为起动阶段指标，选用代谢协作和小鼠耳炎性水肿实验作为促癌阶段指标，选用Hela细胞存活率和软琼脂生长及小鼠S180实体瘤实验，检测对肿瘤细胞存活和增殖的影响。结果发现茶色素与茶多酚在肿瘤发生的起动、促进和增殖各阶段均显示出明显的保护作用；体外给予茶多酚、茶色素处理Hep G2肝肿瘤细胞，发现茶色素及其单体成分及茶多酚可诱导醌还原酶(QR)活性和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性；在用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低；饮用0.1%茶多酚、茶色素可显著诱导大鼠肝GST活性，茶多酚的诱导率为25%，茶色素的诱导率为18%，而且GST1-1、1-2、3-3蛋白表达均有明显升高。结果表明茶色素与茶多酚同样具有抗肿瘤作用，茶色素对具有抗氧化作用和解毒作用的Ⅱ相代谢酶QR和GST具有诱导作用，这可能是茶色素防癌作用的重要机制。

分类号R730.1TS272

Experimental studies on the cancer chemoprevention of tea pigments

Han Chi, Gong Yunyun

(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)

A batch of short-term tests were used to examine the effects of tea pigments on three stages of carcinogenesis, i.e.initiation, promotion and progression. Forward gene mutation test and micronuclei test were used to study the initiation stage of carcinogenesis;metabolic cooperation test and mice ear test to study the promotion stage. Viability and growth ability of Hela cells in soft agar and S₁₈₀ solid tumor test in mice were used to examine the effect of tea pigments on the third stage of carcinogenesis. The results showed that both tea pigments and tea polyphenols had significantly protective effects on initiation, promotion and progression stages in carcinogenesis. In vitro study showed that tea pigments and tea polyphenols could induce QR and GST activity in Hep G2 cells. Oral administration of 0.1% tea polyphenols and 0.1% tea pigments could increase GST activity in rat liver by 25% and 18% respectively,and this increase was accompanied by the significant increase of GST 1-1,1-2 and 3-3 protein expression level in rat liver. Our results suggested that the antrcancer effect of tea pigments was the same as that of tea polyphenols, and the anticancer properties of tea pigments might be mediated by activating the enzymes such as QR and GST,which play important roles in the detoxification and exclusion of carcinogen.

Key words: tea polyphenols,tea pigments,short-term screen test for cancer

近年来国内外科学家运用现代科学技术研究茶的防癌作用，取得大量有意义的结果，许多动物试验证实饮茶对化学物质引起的食道、前胃、肝、大肠、口腔等多处肿瘤的发生具有明显预防作用^［1，2］。当前，寻找茶中的防癌有效成分已成为进一步研究的焦点之一。这方面，国内外学者大都认为茶多酚是茶的主要有效成分，因为茶多酚具有抗氧化、诱导解毒酶、调节机体免疫等作用。然而，我们最近的研究结果表明茶叶中另一类主要成分茶色素对实验性肿瘤也具有不亚于茶多酚的预防作用。茶色素是茶多酚的氧化产物，是红茶的主要成分，其主要成分是茶红素和茶黄素。已有报道，茶色素也具有很强的抗氧化作用。为了进一步研究茶色素的作用及其机理，本研究选择一组体外短期检测试验，对茶色素在致癌过程的起动、促进、增殖阶段的作用进行检测，并与茶多酚的作用进行比较^［3，4］。此外，本研究还对茶色素对实验性肝肿瘤发生的抑制作用、肝细胞抗氧化防御系统、以及对谷胱甘肽硫转移酶多种亚型的表达的影响等进行了一系列探讨。

1材料和方法

1.1仪器设备

超净工作台：Environ Air Control Inc 10319(美国)；CO₂培养箱：(SHEL-LAB 1825TC，美国)；倒置显微镜：(01ympusAT-Ⅱ，日本)；光学显微镜：(Nikon AFX-Ⅱ 日本)；高速电动匀浆器(Tekmar公司，西德)；高速离心机(Beckman GS-15R，美国)；超速离心机(Beckman L7-65,美国)；。电泳仪、电转槽(北京东方特立科贸中心)；台式多用恒温振荡器(江苏省太仓鹿河生化仪器厂)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；电热恒温干燥箱(南通)；薄层扫描分析仪(Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-900,日本)。

1.2材料

1.2.1细胞中国地鼠V79细胞(6TG敏感型)、M细胞(6TG耐受型)、BALB/C3T3细胞株均购自中国医学科学院肿瘤医学研究所，HeLa细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，人肝癌细胞株Hep G2细胞购自北大医院病毒室。

1.2.2主要试剂及其配制CDNB、GSH、二乙基亚硝胺(DEN)、双丙烯酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT)、氮盐四唑(BCIP)(Sigma产品)；丙烯酰胺(Fluka公司)；Tris (Serva公司)；牛血清白蛋白(B.M.公司)；低分子量蛋白质标准(Pharmacia公司)。GST1-1、1-2、3-3的兔抗鼠多克隆抗体由日本Hirosaki University, School of Medicine的Dr.Kimihiko Satoh惠赠。碱性磷酸酶标记兔型二抗(Bio-Rad公司)

DMEM培养液：17.4g DMEM粉(Sigma产品)溶于900ml三蒸水中，全溶后，加入NaHCO₃ 3.7g，定容至1000ml,0.22μm滤膜过滤除菌后分装。临用时加10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素、链霉素。

小牛血清(CS)：购自中国医学科学院基础医学研究所。临用前56℃水浴30min灭活补体。

胰酶(trypsin活力1∶250)：(Sigma产品)，用D-Hank液配成0.25%胰酶、。

丝裂霉素C(MMC)：(Sigma产品)用DMSO配制成1g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。临用时用无血清DMEM培养液稀释至0.25g/L。

松胞素B(CytB):(Sigma产品)用DMSO配制成2g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。用时释释至1g/L。

12-O-十四烷酰基-佛波-13-乙酸酯(TPA)：(Sigma产品)用DMSO配制成0.25g/L的储备液，分装后放-20℃保存。

6-巯基鸟嘌呤(6-TG):(Sigma产品)用0.5% Na₂CO₃溶液配制成1.0g/L溶液，4℃冰箱保存。临用前0.22μm滤膜过滤除菌。

磷酸缓冲液(PBS)：KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.89g、KCl0.2g、NaCl8.0g，溶于三蒸水，定容至1000ml，高压灭菌后，置4℃冰箱保存。

茶多酚、茶色素：茶多酚为淡黄色粉末(40%纯度)，茶色素为棕褐色粉末，为茶多酚的氧化产物，由中国农业科学院杭州茶科所提供。分别称取茶多酚、茶色素10g，溶于三蒸水，定容至100ml(浓度0.1g/L)。用定性滤纸抽滤。三蒸水10倍稀释后0.45μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃冰箱保存，终浓度为0.01g/L。另按所需浓度用蒸馏水溶解。

1.3方法

1.3.1V79细胞基因正向突变试验参照Cajelli等的方法进行^［5］，接种V79细胞6×10⁵/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO₂培养箱中培养24小时后，换无血清培养基，并按选定的浓度加入受试物，作用2小时后，换为含10%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24小时后，分别消化各组细胞，以低密度接种使其表达6天，其间换液消化一次。接种2×10⁵细胞/皿，加6-TG 5mg/L作突变体选择，另外接种200细胞/皿，不加6-TG作存活率测定。培养8天后计数存活和突变集落数，并计算突变率(每1×10⁶个存活细胞中的突变细胞数)和抑制率。

1.3.2V79细胞周期阻滞法微核实验参照Krishna等的方法进行^［6］，接种V79细胞6×10⁵/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO₂培养箱中培养24小时后，加入不同浓度的受试物，除阴性组外，其余组均加阳性物MMC 1mg/L置37℃、5% CO₂条件下继续培养2小时后，加CytB 4.5g/L，再继续培养24小时，消化细胞，制片，Giemsa染色后镜检，计数每1000个双核细胞中的微核发生率。

1.3.3V79细胞代谢协作实验参照Yotti等的方法进行^［7］，混合接种6×10⁵ V79细胞及200M细胞/皿于DMEM