摘要海马区内注射K-银环蛇毒素(K-BGT)可造成小鼠学习记忆明显障碍，以建立早老性痴呆(AD)患者学习记忆缺损模型。对小鼠的损害作用随K-BGT剂量增加而明显增加。水迷宫多项指标测试结果表明，K-BGT损害组小鼠与对照组小鼠相比，空间学习和记忆能力显著下降。明暗回避反应实验结果也表明，K-BGT损害小鼠潜伏期明显缩短，错误次数增多；两种检测方法均表明K-BGT可导致小鼠学习记忆明显障碍，而且这种损害具有持久的作用。

中图分类号R996.3Q593.2R338.26

Animal model for Alzheimer's disease based on the blockade of

neuronal nicotinic acetylcholine receptors

Liu Jiesheng,Xie Liling,Hong An,Chen Shiqiu

Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou510632，China

The intrahippocampus injection of Kappa-bungarotoxin (K-BGT) caused a significant impairment in learning and memory abilities of mice,in order to create an animal model for Alzheimer's disease. The spatial learning and memory abilities in the Morris water maze in the model group (K-BGT impaired mice)decreased significantly compared with control group. K-BGT impaired mice also showed learning and memory reduction with shorter latency and more mistakes in step-through test.

Key words:Kappa-bungarotoxin,animal model,learning and memory,behavior

一般认为老年性记忆力下降与胆碱能神经活动减弱有关^［1，2］。研究发现，早老性痴呆(Alzheimer's disease,AD)患者脑组织乙酰胆碱数量减少，大脑皮层胆碱乙酰化酶(ChAT)和乙酰胆碱脂酯(AChE)活性都降低。乙酰胆碱是记忆痕迹形成的必需神经递质和长期记忆的生理基础，因此损害中枢胆碱能神经系统，可造成早老性痴呆动物模型。

胆碱能神经活动与两类受体有关，其一是毒蕈碱受体，即M-受体，其二为烟碱受体，即N受体。以胆碱能学说为依据，已建立了数种AD动物模型，多以阻滞胆碱能M受体为基础^［3］，尚未见选择性阻滞脑内烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的动物模型的报道^［4］。

银环蛇毒素(Kappa-bungarotoxin,K-BGT)是Kappa-神经毒素家族(Kappa-neurotoxins,K-NTs)的首位成员。Chiappinelli于1983年从台湾产银环蛇毒中纯化^［5］，目前已公认其为脑内烟碱受体α₃β₂亚型的特异性阻断剂。由于发现早老性痴呆症(AD)患者大脑皮质中与K-BGT结合的烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAchRs)数量显著减少^［6］，提示α₃β₂亚型受体可能与学习记忆活动密切相关。

本文以K-GBT毒素为工具，通过阻滞脑内海马α₃β₂亚型受体的功能，模拟AD患者学习记忆缺损模型，开展AD有关的病理机制研究，也为益智类食品和药物筛选提供一种新的模型。

1材料和方法

1.1实验材料

选昆明种小鼠，体重18～22g，由中山医科大学实验动物中心提供。K-BGT，电泳纯，按文献制备^［7］，标准品由美国Chiappinalli，VA实验室提供。

实验数据以±s表示；显著性检验采用t检验和χ²检验。

1.2实验方法

1.2.1行为测试

迷宫由圆形水池及自动录相和记录系统两部分组成。水池直径60cm，水池深30cm，水深25cm，水温(26±1)℃，水中加有墨汁。

实验时将水池人为划分为A，B，C，D四个象限区，见图1。在A区中放置一个直径4cm的平台，没于水下1cm，以平台中心辐射半径5cm的区域为E区，实验时按图1将小鼠面向池壁，从Ⅰ点放入小池，自动录象系统记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径。每只小鼠每天6次(上下午各3次)，连续6天，轮流进行，于第6天第二轮结束后，撤去平台，记录1min内小鼠在池中游泳路径，并计算小鼠在水池各象限及在E区游泳距离占游泳总距离的百分比，进出A区和E区次数，作为评价小鼠学习成绩的指标。Morris水迷宫及避暗法行为测试过程见参考文献^［8］。

图1Morris水迷宫训练示意图

1.2.2动物分组及处理

雄性小鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，麻醉后固定在脑立体定位仪上，切开头皮，在颅骨上钻一小孔，按图谱在Bregma后2.0mm，左右旁开2.5mm处给小鼠海马区注射1μl生理盐水或K-BGT(3.25μg/kg或9.75μg/kg)，注射时间为1min，留针时间1min，注射后立即用牙科水泥封闭颅骨创口，缝合皮肤。每只小鼠每天腹腔注射青霉素钠3.2万单位，连续10天，测试于术后第二天进行。

2结果

2.1K-BGT对小鼠空间学习记忆的影响

小鼠在morris水迷宫中5天对位置识别训练的结果见图2，每个点为每天6次， 每组10只小鼠训练总成绩的平均值。在5天的训练中，对照组的逃避潜伏期不断缩短，第4天比第1天缩短了58.3%，而模型组比第1天仅缩短了16.7%。训练第2天，模型组逃避潜伏期比对照组长56.4%，两组相比，差异显著(P＜0.05)，以后各天两组差距加大。

图2K-BGT对空间学习记忆的影响①NS+NS②NS+K-BGT

在5天训练期结束后，于第6天撤去平台，以小鼠在平台A区和以平台为中心的半径为5cm环内(E区)进出次数及游泳距离占总游泳距离百分比为衡量记忆好坏指标，模型组进入E区次数比对照组少48.9%，进入A区次数少56.5%，两者差异显著(P＜0.05)，表明K-BGT对小鼠空间方位记忆能力有一定影响。

小鼠在A区游泳距离占总游泳距离百分比，对照组为30.2%，模型组为21.2%，模型组比对照组相应指标低33.1%。

小鼠游泳方式典型轨迹见图3。在5天训练期结束后，于第六天撤去平台，小鼠空间搜索过程的游泳轨迹在对照组多以A区为主，即绕平台游泳占40%，穿梭样寻找占30%，作环池游泳占30%，而模型组绕A区游泳仅为总距离20%，穿梭样寻找占30%，环池游泳为主要方式，占50%。经χ²检验，显示各种搜寻方式的构成比在两组中有明显差异(P＜0.05)，这一结果表明模型组小鼠学习行为模式发生了改变。

图3小鼠游泳方式典型轨迹图

撤去平台后的前三天，对照组A区游泳距离百分比均高于模型组(P＜0.05)，表明对平台位置仍保持记忆，但第4d开始记忆消退，与模型组相比已无明显差异。模型组在撤除平台后的6天中，A区游泳距离百分比未有明显变化，见图4。

图4撤去平台后记忆消退的情况

上述结果表明K-BGT对小鼠空间学习记忆及行为模式均有显著的影响(P＜0.05)，这一模型可考虑作为制备学习记忆遗忘症的一种有用工具。

2.2K-BGT对小鼠避暗行为的影响

用避暗法检测被动学习记忆。在学习过程中，对照组和模型组在5分钟内错误次数和潜伏期并无明显差别，各组小鼠一般在十几秒内即可从明区进入暗区。在遇36V电压电击24h后重新检测记忆行为时，对照组潜伏期明显延长，而模型组A及B(分别注射K-BGT3.25及9.75μg/kg)则明显减少，比对照组，K-BGT组潜伏期分别减少了32.4%和76.4%。5min内错误次数对照组为0.8±0.7，与学习前相比下降68.0%，而模型组分别为2.6±1.8和3.5±1.6，其中高剂量组(9.75μg/kg)与对照组相比差异极为显著(P＜0.01)。

图5K-BGT对小鼠避暗行为的影响

3讨论

K-GBT是K-NT家族成员之一，至今已发现有4个家族成员，阻断小鸡睫状神经节烟碱传递的剂量介乎于50～250nmol/L^［9］，以K-BGT毒性为最大。

K-BGT是由66个氨基酸残基组成的多肽，对α₃β₂神经元烟碱受体具有选择性识别，α₃β₄，α₂β₂，α₄β₂不受高浓度的K-B