摘要将黄曲霉毒B₁-牛血清白蛋白(AFB₁O—BSA)连接物免疫注射4只(A、B、C、D)产蛋鸡。研究了抗AFB₁蛋黄抗体的产生进程，除鸡B外，其它3只鸡从第一次注射抗原后的第90天开始有较明显的抗体产生，第135天达到高峰，从第165天开始下降。在抗体产生高峰期，蛋黄抗体A、C、D的间接ELISA效价分别为1∶8000、1∶6000、1∶6000。以蛋黄抗体A为材料，研究了抗体的特异性，结果表明：该抗体有较好的特异性。但是抗体与AFB₁的结构类似物(AFB₂、AFG₂、AFG₁、AFM₁)除AFM₁外都有不同程度的交叉反应，达到50%的竞争抑制率时，AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的灵敏度分别为6、25、125和2495ng/ml。

中图分类号R155.31

Studies on the preparation and characters of anti-AFB₁ antibody from the yolk of laying hens

Chen Fusheng Li Genjiu,Chen Jiuwu,Luo Xingchang,Zhou Qi

Agro-Microbiology Key Laboratories Huazhong Agricultural University, Wuhan430070，China

AFB₁O-BSA conjugates were injected into four laying hens(A,B,C and D).The yolk anti-AFB₁ antibodies A,C and D produced were obviously increased after 90 days of the first injection,and reached the peak after 135 days,and started dropping after 165 days.The indirect ELISA titer of yolk antibodies A,C and D were 1∶8000,1∶6000 and 1∶6000 respectively.The specificity of the antibody A was good, but a cross-reaction with AFB₂,AFG₁,AFG₂, with an exception of AFM₁,was found.The sensitivities of AFB₁,AFB₂,AFG₁ and AFG₂ were 6,25,125 and 2495 μg/L respectively.

Key words:aflatoxin B₁, antibody, laying hen, ELISA

前文已报道AFB₁抗原的构建^［1］，本文将报道抗AFB₁蛋黄抗体的制备及其性质。以自制的AFB₁O-BSA连接物免疫注射产蛋鸡获得了抗AFB₁的蛋黄抗体。蛋黄中的抗体是由鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成的，它与血清中的抗体具有相同的特异性和灵敏度。从鸡蛋中提取抗体不需采血且抗体的量较大，但是用于真菌毒素方面的研究报道甚少^［2］。

1材料与方法

1.1试剂

AFB₁O—BSA连接物(免疫抗原)∶AFB₁O∶BSA的摩尔比为6.3∶1；AFB₁O-OV连接物(包被抗原)∶AFB₁O∶OV的摩尔比为6.1∶1，均为自制产品^［1］。完全和非完全弗氏佐剂；黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁及邻苯二胺均为Sigma公司产品。羊抗兔IgG:HRP酶标二抗，琼脂糖，Tween-20均为华美生物工程公司产品。卡介苗为武汉生物制品公司产品。其它试剂均为实验室常用分析纯试剂。

1.2实验动物

产蛋鸡，150天龄，1.5～2.0kg，华中农业大学动物房提供。

1.3仪器与器材

酶联免疫检测仪ZFQ—85A型，国营华中电子管厂。

1.4方法

1.4.1 免疫方法

以产蛋鸡为实验动物，免疫前从鸡翅静脉采血样制备血清，与免疫抗原(AFB₁O—BSA)进行琼脂双向扩散实验，淘汰出现免疫沉淀带的产蛋鸡。保留不出现免疫沉淀带的产蛋鸡阴性血清。在注射抗原前一周，皮内注射卡介苗以刺激免疫系统，然后每隔30d，分别于第1、30、60、90、120d各注射抗原一次，每次用量1.5ml。在第1、2次注射时与等量的完全弗氏佐剂混匀，以后各次均与等量的非完全弗氏佐剂混匀后注射。于腹部肌肉、背部皮下等处多点注射，重复数为4。

1.4.2 鸡蛋黄抗体的提取^［2］

从鸡蛋中小心分离蛋黄，10ml蛋黄液+40ml 0.1mol/L磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)(以下简称PBS)+10ml氯仿，混匀，以4500r/min离心30min，取上清液加入PEG-8000，使浓度为14%(140mg/g)，沉淀后离心得蛋黄抗体(以下简称为IgY)，溶解于10ml PBS中，再以14%(140mg/g)的PEG-8000沉淀后离心以纯化IgY，将IgY溶于10ml PBS中，此即为蛋黄抗体添加0.05%叠氮化钠，4℃保存备用。

1.4.3蛋黄抗体效价的测定

用间接非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)^［3］。

以蛋黄抗体吸光值两倍于阴性血清吸光值时蛋黄抗体的最大稀释倍数作为抗体的效价。

1.4.4抗体的特异性：

用间接竞争ELISA法^［4］。

以竞争抑制率达到50%时所对应的毒素浓度作为灵敏度。

2结果与分析

2.1抗体的产生进程

采用多点、多次注射抗原的免疫方法免疫产蛋鸡，从第1次注射抗原后的第30天开始每隔15天收集鸡蛋，提取蛋黄抗体，按1∶2000稀释，以间接非竞争ELISA测定吸光值(A)，以A作为纵坐标，取样间隔的天数为横坐标，如图1所示得到抗体产生进程曲线。

图1抗体产生进程曲线

从图1可以看出，除鸡B外，其它鸡都能产生较好的抗体，抗原注射90天后才有较明显的抗体产生，第135天达到高峰，从第165天开始下降。

2.2抗体的效价

在抗体产生高峰期，取鸡A、C、D的蛋黄抗体(+)及其阴性血清(-)进行稀释，用间接ELISA测定效价，结果如图2。表明鸡A、C、D的蛋黄抗体效价分别为1∶8000、1∶6000、1∶6000。

图2间接ELISA测定蛋黄抗体和阴性血清的效价

2.3抗体的灵敏度和特异性

本研究是以AFB₁及其结构类似物，黄曲霉毒素B₂(AFB₂)、黄曲霉毒素G₁(AFG₁)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂)、黄曲霉毒素M₁(AFM₁)作为竞争抗原，对蛋黄抗体A的灵敏度进行了分析，以间接竞争ELISA中抑制率达到50%时所对应的毒素浓度为灵敏度，结果如图3。

图3蛋黄抗体A的竞争ELISA抑制曲线

图中横坐标各点所对应的毒素浓度(C)分别：0.0125，0.125，1.25，12.5，125，1250，12500ng/ml。

从图3可以得出：AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁的灵敏度分别为6、25、125、2495ng/ml和无穷大(即在图中看不出)，数值越大灵敏度越差。

抗体的特异性是以AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁的灵敏度与AFB₁灵敏度的比值来表示，分别为：1、4.2、20.8、416和无穷大，数值越大特异性越差，即蛋黄抗体A的特异性按AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁为序，顺序降低。

3讨论

3.1抗体的灵敏度

灵敏度是衡量抗体质量的一个重要的指标，表示方法很多，通常是以最低检出量作为灵敏度，但是在实际应用中以最低检出量为灵敏度时存在着重复性差的缺点，这样，在相同的实验条件下在不同的实验中，同一种抗体也可能出现多个灵敏度，这显然是不合理的。本研究以间接竞争ELISA中，当抑制率达到50%时所对应的毒素浓度为灵敏度，其重复性好、运用方便。

3.2抗体灵敏度与抗原结构的关系

黄曲霉毒素是结构很相似的一类化合物，它们都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。目前已发现并清楚化学结构的黄曲霉毒素及其衍生物、异构物多达27种，其中在食品和饲料中常见并对人畜有较大危害的主要是AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁、AFM₂等，它们的结构式如图4所示。根据结构式结合图3中灵敏度的分析结果，容易发现灵敏度主要与双呋喃环结构有关：图3结果表明：AFB₁、AFB