摘要本文通过丙烯腈对大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase和磷酸化酶A活性影响的研究，探讨了丙烯腈对动物肝脏钙稳态的影响，进一步阐明丙烯腈的毒作用机制。采用成年雄性SD大鼠，每天经口染毒，染毒剂量为0、10、30和50mg/kg，连续染毒42天，于染毒第14天、28天和42天时分别测定各组肝匀浆Ca²⁺-ATPase和磷酸化酶A的活性。结果显示，丙烯腈可明显地抑制肝脏Ca²⁺-ATPase(P＜0.01)，同时可显著地激活磷酸化酶A的活性，特别是高剂量组(50mg/kg)和染毒42天时影响最明显，相关关系分析表明，丙烯腈对Ca²⁺-ATPase和磷酸化酶A的活性的影响均存在较好的剂量-反应和时间-反应关系(P＜0.01)。结果认为丙烯腈能显著地抑制大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase和激活磷酸化酶A的活性，可导致大鼠肝脏钙稳态的失调。

中图分类号Q593.1R135Q55

Effect of acrylonitrile on the activity of Ca²⁺-ATPase

and phosphorylase A of liver in rats

Zhang Zhengdong,Wang Xinru,Zhou Jianwei,Gao Suqin,Jin Xipeng

Laboratory of Molecular Toxicology,School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

The activity of Ca²⁺-ATPase and phosphorylase A(P-A) of liver in rats was determined to study the effect of acrylonitrile (ACN) on calcium homeostasis and to clarify the toxicological mechanism of ACN. Adult male Sprague-Dawley rats were administered ACN daily per os for 42 days, at the dosage of 0,10,30 and 50 mg^.kg^-1. The activities of Ca²⁺-ATPase and phosphorylase A was determined at 14,28,42 days after ACN administration. The results indicated that ACN could significantly inhibit the activity of Ca²⁺-ATPase and increase the activity of P-A (P＜0.01),especially in the high dose group and exposed for 42 days, and there was significantly dose-and time-respond relationship (P＜0.01). ACN contamination could result in the disharmony of calcium homeostasis of liver in rats.

Key words: acrylonitrile, Ca²⁺-ATPase, phosphorylase A

丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是制造腈纶纤维、丁腈橡胶、工业塑料和合成树脂等的重要有机合成单体，是职业环境中重要的有害污染物之一^［1］。有研究表明，ACN具有明显的急、慢性毒作用，对动物具有明显的致癌作用，是人类的可疑致癌物。但迄今为止有关ACN的毒作用机制尚不十分清楚。本文通过ACN对大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase和磷酸化酶A(phosphorylase A,P-A)活性影响的研究，以进一步探讨ACN的毒作用机制。

1材料和方法

1.1动物

健康成年雄性SD大鼠，体重(120±10)g，由江苏省实验动物中心提供。

1.2重要试剂和药品

ACN(A.R，北京福星化工厂，含量＞98%)。ATPase试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3方法

1.3.1动物染毒试验

SD大鼠120只，随机分为4组：对照组和A、B、C(10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg)3个染毒组，每组30只。ACN染毒液以蒸馏水配制，经口给予，每日1次，连续染毒42天，每7天称重1次以校正灌胃量。对照组动物以蒸馏水灌胃。各组动物于染毒第14天、28天和42天时随机取8只或10只动物，禁食12h，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净，滤纸吸干，以冷1.15%KCl制备10%肝匀浆用于Ca²⁺-ATPase活性测定；同时以介质液(含100mmol/L NaF、20mmol/L EDTA、0.5%糖原和50mmol/L甘氨酰甘氨酸)制备10%肝匀浆用于P-A活性测定。

1.3.2测定指标

P-A活性测定参照崔京伟介绍的方法进行^［3］，酶活性单位以每克蛋白质催化生成的无机磷毫克数表示(mg/g)；Ca²⁺-ATPase活性测定按试剂盒说明操作，酶活性单位以每分钟每克蛋白质催化生成无机磷微摩尔物质的量表示［μmol/(g^.min)］。

1.4统计方法

采用Sigmastat v1.0统计软件对多组间均数进行方差分析，并采用Dunnett's方法检验两组均数间的差异；采用线性回归方法分析剂量-反应和时间-反应关系。

2结果

2.1ACN对大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase和P-A活性的影响(见图1～2)

图1丙烯腈对大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase活性的影响

图2丙烯腈对大鼠肝脏P-A活性的影响

从图1可知，随染毒剂量的增大和染毒时间的延长，Ca²⁺-ATPase活性呈逐渐下降趋势，经统计学检验有显著性差异(P＜0.01)，其中C组(50mg/kg)各染毒时段Ca²⁺-ATPase活性均显著低于对照组(P＜0.05)，A、B组(10mg/kg和30mg/kg)在染毒第42天时Ca²⁺-ATPase活性也显著低于对照组(P＜0.05)；当染毒第28天时C组以及染毒第42天时各染毒组Ca²⁺-ATPase活性均明显低于染毒14天时的酶活性(P＜0.05)。从图2可以看出，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，P-A活性呈逐渐升高趋势，经统计学检验，除染毒14天外，其它各组均存在显著性差异(P＜0.01)，其中染毒第28天时B和C组及染毒第42天时所有染毒组P-A活性均显著高于对照组(P＜0.05)，且染毒28天时C组和染毒42天时所有染毒组P-A活性均明显高于染毒14天时酶的活性(P＜0.05)。

2.2ACN对大鼠肝脏Ca²⁺-ATPase和P-A活性影响的剂量-反应和时间-反应关系分析

随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，Ca²⁺-ATPase活性均逐渐降低，而P-A活性均逐渐增高，除染毒14天P-A活性随染毒剂量增大无明显变化外，其它各组均具有显著性意义(P＜0.01)，特别是C组和染毒第42天时段Ca²⁺-ATPase和P-A活性与染毒剂量和染毒时间之间相关程度最高。

上述结果表明ACN对Ca⁺-ATPase活性的抑制和P-A活性的激活具有良好的剂量-反应和时间-反应关系。

3讨论

ACN属于有机氰类化合物，主要在肝脏经混合功能氧化酶(mixed function oxidase,MFO)生成具有亲电子性的中间产物2-氰环氧乙烷(2-cyanoethylene oxide,CEO)。ACN原型和CEO均可与GSH结合而最终以硫氰酸盐形式由尿排出体外，同时也消耗了体内的GSH。近年来有研究还表明，体内能产生活性氧类(reactive oxygen species,ROS)的酶在ACN的代谢活化中是必需的^［4］。这些代谢过程可导致机体活性氧清除系统(如GSH、SOD等)的耗竭，引起机体的氧化性损伤^［5］。氧化损伤的结果可能导致机体钙稳态失调和DNA的断裂损伤，这是毒物导致细胞损伤、死亡甚至癌变的重要基础^［5］。

本研究结果表明，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，ACN均可明显地抑制Ca²⁺-ATPase，同时可显著地激活P-A，并呈现良好的剂量-反应和时间-反应关系。已知Ca²⁺-ATPase和P-A均为细胞质膜上重要的酶，能调节细胞浆内游离Ca²⁺浓度，使之处于较低水平(约10^-7mol)，因而对维持细胞钙稳态具有重要的作用^［5］。Ca²⁺-ATPase活性被抑制，导致胞浆内游离Ca²⁺移出胞外和/或移入细胞器内的过程发生障碍，使胞浆内Ca²⁺浓度持续升高，继而可作为激活因子激活P-A，破坏细胞骨架和膜磷脂成分，最终将可能导致细胞结构的损伤、死亡甚至发生癌变。以上结果提示，ACN可导致动物肝脏钙稳态的失调，这可能是ACN急慢性中毒和致癌的重要机制。

*江苏省教委自然科学基金资助课题(项目号96036)

作者简介：张正东，男，讲师，博士研究生

参考文献

1.Environmental Protection Agency(EPA).National emission standards for hazardous air pollutants for source categories:Organic hazardous air pollutants from the synthetic organic chemical manufacturing industrial and seven other processes.Fed Regist,1992,57:62602—62608

2.Page NP，Cook B.Assessment of risk exposure to acrylonitrile:The general approach used by a consultant.Sci Total Environ，1990,99:307—316

3.崔京伟，江泉观.大鼠肝脏磷酸化酶a活性测定法介绍.卫生毒理学杂志，1989，2<