国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第6期

四川省卫生管理干部学院（610041）

杨朝国 王明谊 吴磊综述 安乙敏审校

摘要 金黄色葡萄球菌仍是医院的致病性和致死性的一个主要原因，尤其是耐药菌株。可引起暴发性感染、散在感染和无症状携带者，故需要特异、快速的流行病学分型去追踪细菌的传播与进化。本文介绍了近年来DNA扩增技术在金黄色葡萄球菌分型中的应用研究进展。

关键词：金黄色葡萄球菌；DNA扩增分型技术；影响因素

金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的主要病原体。在80年代耐甲氧苯西林金黄色葡萄球菌（MRSA）以惊人的频率出现，因此在过去十几年里MRSA的传播分析是研究焦点，已证实MRSA菌株间高度遗传学相关性是应用常规细菌学方法进行流行病学分析的障碍。目前金黄色葡萄球菌流行病学分型的方法有两大类，一是表型标记分型包括噬菌体、血清学、生物学、抗生素、英膜多糖、细胞表面蛋白电泳（免疫印迹）和multilocus酶电泳（MLEE）等；二是基因分型包括质粒作图、质粒限制性片段图谱、基因组DNA探针-RFLP、核糖体探针-RFLP、IS257/431探针、巨大限制性片段脉冲凝胶电泳（PFGE）、倒转凝胶电泳（FIGE）和基于DNA扩增的指纹图谱等^[1,2。常用五个指标来评价分型系统，①分型能力，对每种分离物提供肯定结果的能力；②重复性，当菌株重复实验时产生相同结果的能力；③分辨力，区分无关分离物的能力；④容易解释和应用；⑤费用。目前的所有方法均有敝端，基因组DNA分型和免疫印迹最适于流行病学分析^[1]。表型标记分型方法临床实验室容易获得，但生物学方法分大多亚型，不宜用于流行病学分析，其它方法分辨力低，且表型特征不稳定，随时间推移易变。在过去5年中，基因组分型成为金黄色葡萄球菌流行病学分型的有力工具，PFGE优于其它基因分型方法，图谱稳定，分辨力高，但费时、费力，图谱解释困难，且实验室间标准化仍有问题^[3]；质粒易丢失和获得，探针杂交和RFLP繁琐、费时，而且分辨力有限。近年来大量报道了用PCR对重要医学细菌基因分型，该法简单、快速，但重复性有待提高^[4]。多态性DNA序列任意扩增用于细胞分型的方法主要有任意引物PCR（AP-PCR）、随机扩增多态性DNA（RAPD）和DNA扩增指纹，它们统称为多任意扩增物图谱（MAAP）。本文拟对DNA扩增技术在金黄色葡萄球菌分型中的应用研究进展作一概述。

1 PCR扩增的基因及其分型应用

1.1 凝固酶基因^[1,5] PCR扩增凝固酶基因3′端含81-bp串联重复序列的高变区，产生能用AluⅠ消化辨别的不同大小片段，进行RFLP分析。Goh等证实该法和MLEE结果高度相关。Tenover等用巢式PCR扩增凝固酶基因，外侧引物GGOAG1 aTACTCAACCGACGACACCG和COAG4GATTTTGGAGAAGCGGATT，内侧引物COAG2 cGAGACCAAGATTCAACAAG和COAG3 AAAGAAAACCAC TCACATCA，59株金黄色葡萄球菌均可分型（7型），对29个暴发感染菌株中的28个作出了正确鉴定，但8个无关菌株被错定为暴发菌群。Andreas等用引物COAG2和COAG3拉增PFGE区分的30个流行病学无关菌株凝固酶基因，18株有独特的AluⅠ图谱，其余12株只观察到4种图谱，说明无关菌株有相同的的AluⅠRFLP图谱。该法分辨力不如PFGE。

1.2 SPA基因^[6,7] SPA基因的X区含有24-bp重复序列组成的高度多态性序列，Frenay等用引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCTAAAAAGCTAAACGATGC-3′和5′-CAGGAAACAGCTATGACCCCACCAAATACAGTTGTACC-3′扩增X区，产物用RsaⅠ酶切，既可分型又可区分流行性和非流行性MRSA菌株，大多数流行性MRSA菌株（24/33）有7个以上或更少的重复序列。Kluytmans等用该方法分析17个暴发感染相关菌株，均显示11个重复序列。

1.3 tar916-shidaPCR^[8] 以25℃复性，用引物AGAGAGCTATTTTA扩增于转座子Tn916靶位点侧的DNA序列和引物AAAGGAGGAATTA扩增核糖体结合位点和邻近核苷酸序列，这二个PCR的起动点随机地分布在金黄色葡萄球菌染色体上，扩增产物图谱能区分金黄色葡萄球菌的主要克隆群菌株（噬菌体型29，＋，94，96，95和Ⅱ群、Ⅲ群等共24株MSSA）和鉴定6个流行性MRSA菌株，这些菌株均可分型。流行性MRSA在不同医院间传播时，tar916-shidaPCR图谱稳定。实验中用三种不同的DNA制剂和二种聚合酶（Taq、Replitherm），PCR图谱均可重复。Tar916-shindaPCR可产生足够分辨力的产物图谱，加上简单的DNA提取方法，其对常规监测中金黄色葡萄球菌流行病学分型很有用。

1.4 重复共有序列已在大肠艾希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和其它G^N菌的基因组中发现了124～127bp肠道菌重复基因间共有（ERIC）序列，均有30～150个拷贝。ERIC序列尚未证实存在于金黄色葡萄球菌或其它G^P菌中，故用低温（25℃）复性产生PCR指纹图谱。对GP菌更好的模板是新近发现的BOX序列，154bpBOX序列已在肺炎球菌基因组中发现，约有25个拷贝，其由三个亚单位组成，从5′→3′依次为boxa（59个核苷酸）、boxb（45个核甘酸）和boxc（50个核苷酸）。所有这些基因序列遗传稳定，在种间仅拷贝数和位置变化，是菌株辨别的理想模板，以这些重复序列为模板的引物的增称为rep-PCR。

van Belkum等^[9]对来自两个城市7所医院的39株MRSA菌株进行多基因分型，核糖体探针分为二型；PFGE能鉴定所有MRSA间的遗传学同源性；38/39MRSA属于菌株的单一遗传学同源性群；ERIC2引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′的AP-PCR产生三种不同的图谱。Van belkum等^[4]应用ERIC2、1（GGTTGGGTGAGAATTGCACG）和7（GTGGATGCGA）三条引物对60个菌株（59株金黄色葡萄球菌，1株中间型葡萄球菌）进行AP-PCR分型，结果60个菌株可分型，AP-PCR优于噬菌体、质粒、某些RFLP和IS图谱分型，引物ERIC2和7的分辨力高于引物1，恒定的PFGE型菌株有可变的AP-PCR型，亦观察到相反情况。Kluytmans等^[7]用AP-PCR研究27名病人和14名医务工作者的一次暴发感染MRSA菌株，应用ERIC（5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′）、ERIC2、1、7和188（5′-AAGAGCCCGT-3′）五条引物对30个菌株进行AP-PCR分型，AP-PCR和PFGE把17个暴发感染相关菌株分别分为一个型（三个亚型）和二个型（三个亚型），把13流行病学无关菌株分为7型和5型（6个亚型），有些菌株AP-PCR不能区分，但PFGE可辨别，亦观察到相反情况。AP-PCR和PFGE分辨力优于PCR介导的SPA基因分型和IS431探针分型。

近年来fluorophore-enhanced rep-PCR(FERP)作为病原菌的分子指纹方法^[10]，其把rep-PCR和荧光检测相结合，在引物5′端共价结合fluorophore，荧光PCR产物经PAGE电泳，用激光扫描仪检测结果。Vecchio等^[2]用来自肺炎支原体重复序列（任意染色体分布，数量和位置可变）RepMP3的引物RW3A5′-TCGFCTCAAAACACGACACC-3′，以54℃复性，对170人不同来源的MRSA菌株进行rep-PCR和FERP分析，观察到8种rep-PCR图谱（3～21条高明亮度EB染色带），21个MSSAA菌株显示出与MRSA不同的指纹，rep-PCR观察到的所有带在FERP分析中均观察到，但MRSA共有的325bp带被FERP分成315～390bp范围内的二条带，这可能是PAGE电泳分辨力高之故。该法是医院感染MRSA分子流行病学分型快速方法。

2 影响扩增的DNA指纹可靠性和重复性的因素

由于在25℃下引物可与模权DNA非特异结合，故低严格复性温度（25℃）的单一引物扩增保守的基因间重复共有序列同MAAP一样，扩增的图谱和重复性受到许多因素的影响^4,11]，它们产生的图谱是人为可变性和真正多态性混杂在一起的结合物，重复性很差。影响因素包括：①Mg²⁺浓度；②Taq聚合酶浓度和来源厂商；③DNA浓度、制备方法和二级结构；④引物的浓度、长度、G＋C含量、批间差、性质和选择；⑤引物/模板比率和相互作用；⑥热循环仪型号和厂商；⑦变性时间、复性温度、延伸时间、循环次数和时间及批间温度；⑧RNA污染；⑨凝胶类型；⑩实验室间变异原因：反应体积、聚合酶类型（Taq、Tth、Thp）和用量，Mg²⁺、dNTPs和KCI浓度、热循环仪、琼脂糖类型和浓度，电泳的电压和移动距离，电泳期间EB存在与否，用于电泳的产物体积等。

2.1 模板DNA在各种复性温度下DNA浓度均能影响产物图谱，包括带数量和亮度^[2,11]。在低复性温度条件下，DNA在50mg～0.5μg内，ERIC-PCR产生稳定图谱，＜5ng时可见到与水空白对照管背景带相应的额外带；＜5ng时，几乎检测不到模板扩增^[11]。因此DNA浓度应准确测定和优化，荧光计与Hoechst33258染料结合测定DNA浓度优于分光光度法。在RAPD分析中，由于菌株间生长可变因素影响DNA图谱和全细胞制剂含有使模板和PCR产物降解（除非加入EDTA或放-20℃）的核酸酶，故应避免用全细胞细菌培养物，但在高复性温度下，全细胞rep-PCR已获成功。

2.2 引物 引物浓度降低，图谱带数量和亮度降低，甚至低产量或无扩增；引物浓度太高，出现错配的频率增加，产生更多的非特异扩增。引物浓度理想范围与菌种密切相关，有的细菌对变化更敏感。几条引物必须筛选，一些引物扩增效果和重复性更好，筛选产生适当复杂的图谱的引物和几条引物合理搭配联合应用可产生更详尽的和可重复图谱^[12]，并提高分辨率。为提高分析效率，每种引物和使用的DNA模板都应优化，即使是最佳条件在其它实验室或同一实验室的今后时间均不可重复^[4]。

2.3 引物/模板浓度比率