摘要：目的研究甲基汞对急性分离的大脑皮层神经细胞内游离Ca²⁺水平的影响。方法采用钙离子指示剂Fura-2双波长荧光检测技术。结果（0.10～5.00）×10^-6mol/L甲基汞可使大脑皮层神经细胞内游离Ca²⁺水平显著升高，且有剂量-效应关系。甲基汞升高神经细胞内游离Ca²⁺的作用与胞外Ca²⁺大量内流和胞内储Ca²⁺释放有关，且以胞外Ca²⁺内流为主。胞外Ca²⁺内流与N-甲基-D-天冬氨酸受体门控Ca²⁺通道以及电压门控Ca²⁺通道有关，而与电压依赖性Na⁺通道无关。结论甲基汞可使神经细胞内游离Ca²⁺浓度异常升高，且与Ca²⁺通道有密切关系。

Effects of methylmercury on intracellular free calcium content in cerebral cortical neurons

ZHU Weiguo,CHEN Xuemin，ZHUANG Zhixiong，et al.

(Department of Environmental Health，Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)

Abstract：ObjectiveThis study was conducted to explore effects and potential mechanism of methylmercury on concentration of intracellular free calcium (Ca²⁺) in the acutely isolated cerebral cortical neurons.MethodsCalcium ion indicator Fura-2 two wave-length fluorophotometry was used to measure concentration of Ca²⁺.Results(0.10～5.00)×10^-6 mol/L of methylmercury could increase level of free intracellular Ca²⁺ in cerebral cortical neurons significantly (P＜0.01), in a dose-response manner. Increase in intracellular free Ca²⁺ of neurons caused by methylmercury associated with large influx of Ca²⁺ outside cells and release of stored Ca²⁺ inside cells, especially by influx of Ca²⁺ outside cells. Influx of Ca²⁺ outside cells associated with Ca²⁺ channels regulated by receptor gate and potential gate, but not associated with sodium-dependent channel.ConclusionMethylmercury lead to abnormal increase of intracellular free Ca²⁺ in neurons, which is closedly related to Ca²⁺ channel.

Key words：Methylmercury compounds；Cerebral cortex；Calcium；Neurons

有研究表明，甲基汞的神经毒性与其所致神经细胞胞内游离Ca²⁺水平的异常持续增高有关，但其机制尚不十分清楚^［1，2］。我们采用双波长荧光光度法检测甲基汞对胞内游离Ca²⁺水平的影响，并对其可能的机制进行了探讨。

材料与方法

1．试剂与仪器：氯化甲基汞（MMC、≥98%、Merck公司生产），钙离子指示剂Fura-2/AM、α-氨基-5-磷戊酸(AP₅)、memantine、河豚毒素(TTX)、verapamil、Triton X-100均为Sigma公司产品，胰蛋白酶（Difco进口分装），DMEM培养基和胎牛血清（Gibco、BRL），其他试剂均为国产分析纯。RF 2000型荧光分光光度计（日本岛津）501型超级恒温水浴器（上海试验仪器厂），LDZ-5-2离心机。

2．测定原理：Fura-2因亲水性较强难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后与细胞温育时很容易透过细胞膜。Fura-2/AM进入细胞后，在胞内酯酶作用下水解成Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞浆内游离Ca²⁺结合形成Fura-2-Ca²⁺复合物。Fura-2及其与Ca²⁺结合的复合物的最大激发光波长分别为380 nm和340 nm，其发射光的强度与Ca²⁺浓度呈比例关系。据此可由公式计算出胞内游离Ca²⁺浓度=Kd（F₀F_s）（R-R_min）/（R_max-R），式中Kd值为224 nmol/L，F₀和F_s分别代表Ca²⁺为零及饱和状态下测得的荧光强度，R为实验观察到的荧光比值，R_max和R_min分别为最大和最小的荧光比值，即在＞1 mmol/L游离Ca²⁺浓度和大于等于此Ca²⁺浓度2倍的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)情况下，分别加入0.1% Triton X-100后所测定的荧光比值，在计算游离Ca²⁺之前，应减去在没有负载Fura-2的细胞中测得的自发荧光和背景荧光。

3．单细胞悬液制备：参照文献［3］的方法，取新生SD大鼠，剥离出脑组织，迅速分离出大脑皮层。在冷Hank液（NaCl 137 mmol/L、KCl 5.0 mmol/L、CaCl₂ 1.3 mmol/L、MgSO₄ 0.8 mmol/L、Na₂HPO₄ 0.6mmol/L、KH₂PO₄ 0.4mmol/L、NaHCO₃ 3.0mmol/L、右旋葡萄糖5.6 mmol/L、pH值7.4）中清洗2次，仔细剥离、剔除软脑膜和血管，再用Hank液洗2次。把脑组织置于小烧杯中，用剪刀剪至1 mm³大小，加入预温的0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，消化结束后用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。过250目筛，滤液经1 500 r/min离心10 min，再用Hank液洗2次。最后用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×10⁸/ml，用锥虫蓝染色检查细胞存活率，要求不低于95%。

4．Fura-2/ AM 负载：在上述单细胞悬液中，加入Fura-2/AM应用液，使终浓度为5 μmol/L。37℃恒温水浴振荡45 min，负载后细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清，再用含0.2%牛血清白蛋白的Hank液洗2次。最后用无镁的Hepes-Hank缓冲液（Hepes 10 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaCl 145 mmol/L，CaCl₂ 1.3 mmol/L，右旋葡萄糖10 mmol/L，Na₂HPO₄ 1 mmol/L，pH值7.4）悬浮细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，锥虫蓝染色检查细胞存活率，要求不低于90%。测定前细胞37℃预温3 min。

5．荧光测定：激发光光栅和发射光光栅均为10 nm，激发波长为340 nm和380 nm交替扫描，激发光波长变换时间1 s，发射光波长为510 nm。测定时先分别测定340 nm和380 nm激发光所产生的荧光强度，求出R值，再加入终浓度为0.1%的Triton X-100进行测定，求出R_max值，最后加入5 mmol/L EGTA（pH＞8.5）进行测定，求出R_min值，再根据前述公式计算游离Ca²⁺。

6．处理因素：研究甲基汞对胞内游离Ca²⁺影响时，于负载好的细胞悬液内，加入甲基汞使其终浓度分别为0.00、0.01、0.10、1.00、2.00、5.00 μmol/L，37℃恒温水浴10 min，再进行测定；研究甲基汞影响胞内游离Ca²⁺的机理时，先在负载好的细胞悬液内，分别加入终浓度为AP₅10 μmol/L，memantine 100 μmol/L，verapamil 10 μmol/L，TTX 5 μmol/L，37℃恒温水浴10 min，再加入终浓度为2 μmol/L的甲基汞，37℃恒温水浴10 min后进行测定；研究在无胞外Ca²⁺条件下，甲基汞对胞内游离Ca²⁺的影响时，用不含Ca²⁺、含EGTA 5 mmol/L的Hepes-Hank液代替含CaCl₂ 1.3 mmol/L的Hepes-Hank液，其他操作条件不变。所有的负载细胞在各种处理完成后10 min内测完。

结果

1．甲基汞对大脑皮层细胞胞内游离Ca²⁺的影响（n=5）：当胞外Ca²⁺浓度为1.3 mmol/L时，静息状态下大脑皮层神经细胞游离Ca²⁺浓度为（107.79±6.85） nmol/L，与文献报道一致^［4］，也在正常的神经细胞游离Ca²⁺（100～200 nmol/L）范围内。用甲基汞(分别为0.01、0.10、1.00、2.00和5.00 μmol/L）处理细胞后，大脑皮层神经细胞游离Ca²⁺明显升高，分别为(122.03±11.08)、(163.83±16.19)、(396.27±51.66)、(730.68±79.80)和(1 285.29±166.87) nmol/L，除0.01 μmol/L组外，与对照组相比，差异均有非常显著性（P＜0.01），且随甲基汞浓度的增加，胞内游离Ca²⁺也增加，具有良好的剂量-效应关系（大脑皮层r=0.992，P＜0.05）。

2．甲基汞升高胞内游离Ca²⁺机理的探讨（n=3～5）：在胞外Ca²⁺为1.3 mmol/L时，预先用上述试剂处理细胞10 min，可在一定程度上减弱甲基汞的升钙作用（P＜0.05），作用强弱的顺序为verapamil＞AP₅＞memantine；其游离Ca²⁺浓度分别为（353.87±39.58） nmol/L、（470.91±56.39） nmol/L和（525.30± 72.11） nmol/L；与甲基汞组比较，分别为P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05。verapamil的拮抗作用最强；TTX无明显作用，其游离Ca²⁺浓度为（729.22±83.18） nmol/L。在胞外Ca²⁺浓度为0.0 mmol/L时，2.00 μmol/L甲基汞37℃温育10 min，大脑皮层神经细胞游离Ca²⁺浓度（169.10±17.06） nmol/L仍明显高于对照组游离Ca²⁺浓度（87.16±6.94） nmol/L，P＜0.01。

讨论

本研究利用80年代发展起来的钙离子指示剂Fura-2和双波长荧光检测技术进行研究，发现甲基汞在（0.10～5.00）×10^-6 mol/L 范围内，可使急<