第二军医大学学报2000年第21卷第4期

王昌惠刘忠令

摘要目的：观察吸烟或不吸烟者肺泡巨噬细胞凋亡的变化。方法:对吸烟或不吸烟者肺泡巨噬细胞进行染色观察及流式细胞仪DNA分析。结果:吸烟者肺泡巨噬细胞生存时间延长，吸烟组存活率为（76.3±12.5）%，不吸烟组为（55.4±11.6）%，两者差异显著(P＜0.05)。荧光染色吸烟组凋亡细胞百分率为(38.6±11.5)%，不吸烟组凋亡细胞百分率为（59.4±12.1）%。流式细胞仪观察凋亡细胞百分率吸烟组为(11.5±10.4)%，不吸烟组为(29.1±8.6)%。吸烟组巨噬细胞凋亡较不吸烟者明显减少。结论:烟雾中某些成分可能通过抑制巨噬细胞凋亡，在肺气肿的发病中起重要作用。

关键词：巨噬细胞；凋亡；吸烟

肺泡巨噬细胞在肺泡内占细胞总数的80%,并在肺的多种疾病的发生、发展中起重要作用，吸烟是肺气肿发病的重要因素，吸烟者肺泡巨噬细胞明显增多^［1］，本研究拟通过观察和分析肺泡巨噬细胞的凋亡情况，探讨吸烟者肺泡巨噬细胞增多原因，以及在肺气肿发病中的作用，为肺气肿的预防提供新的途径。

1材料和方法

1.1研究对象吸烟者 8人，男7人，女1人，(吸烟数每年均大于200支/年，近3 d仍吸烟)，不吸烟者8人，男6人，女2人,为健康者，上述对象年龄35～53岁，平均年龄45岁，均无肺部急性炎症和肿瘤等疾病。按纤维支气管镜常规操作，取右中叶支气管行支气管肺泡灌洗。0.9% 生理盐水100 ml分5次注入，灌洗液经接纳器回收，灌洗液回收率60%～80%。将灌洗液经过一层无菌纱布过滤，4℃低温离心(1 000 r/min×5 min），弃上清液，沉淀的细胞用0.01 mol/L PBS 液冲洗，离心2次,计数。制成10⁶个/ml细胞悬液。在RPM i 1640+15%小牛血清孵箱内培养4 h，待巨噬细胞贴壁后弃去培养液,用Hank液轻轻吹打冲洗后弃去，重复2次，再次加入RPMI 1640+15%小牛血清培养液，置5% cO₂ 孵箱中培养24 h。取出培养瓶用刮匙轻轻将贴壁细胞刮下，离心(1500 r/ min×5 min）用PBS 制成细胞悬液5 ×10⁶个/ml备用。

1.2细胞存活率计数取细胞悬液5滴，加入0.4% 锥蓝液1滴，静置5 min，吸一滴混合液点于载玻片上，直接用盖玻片封片，光镜下观察200个细胞，3次，取平均值。未染色为活细胞，着色为死亡细胞。

1.3细胞凋亡观察

1.3.1荧光染色观察^［2］取细胞悬液95 μl和荧光染色液5μl，混匀，37℃静置5 min，吸1滴混合液点于载玻片上，直接用盖玻片封片，荧光显微镜下观察，计200个细胞，3次，取平均值。

1.3.2流式细胞仪观察^［3］取细胞混悬液0.9 ml加纯乙醇2.1 ml，混匀，4℃保存过夜，PI染色法染色，上机检测 DNA含量。

1.4统计学处理实验数据以χ²检验。

2结果

2.1细胞存活率培养24 h后锥蓝染色，死亡细胞在光镜下表现为细胞核被染为浅蓝色，而活细胞为透亮，不着色。细胞存活率，吸烟组为(76.3±12.5)%，不吸烟组为(55.4±11.6)% ，两者相差显著（P＜0.05）。

2.2荧光染色观察荧光显微镜下凋亡细胞为橙红色，活细胞为绿色。凋亡细胞皱缩，核固缩裂解，核仁偏移靠边。吸烟组细胞凋亡率为(38.6±11.5)%，不吸烟组细胞凋亡率为（59.4 ±12.1 ）% ，两者相差显著（P＜0.05）。

2.3流式细胞仪观察凋亡细胞在DNA直方图上可见G₁峰前出现亚二倍体峰，分析细胞凋亡率，吸烟组为（11.5±10.4）%，不吸烟组为（29.1±8.6）%，两者相差非常显著（P＜0.01，图1）。

图 1流式细胞仪检测吸烟组与不吸咽组肺泡巨噬细胞凋亡情况

fig 1Flow cytometry shows the defferent apoptic rate of alveolar macrophages between 2 groups

a：Smoker group;B:Nonsmoker group

3讨论

本研究结果提示吸烟者肺泡巨噬细胞数较不烟者相对增多可能与细胞凋亡减少，生存时间延长有关。肺泡巨噬细胞的增多，在肺气肿的形成和发展中有重要意义。现今的观点认为蛋白酶-抗蛋白酶系统平衡是维持肺泡组织正常结构的基础，如两者平衡失调，就会导致肺气肿的发生。肺泡巨噬细胞数量的增加，必然在进行免疫反应时释放更多的蛋白酶及通过释放各种趋化因子招募更多的中性粒细胞，而中性粒细胞释放的蛋白酶对肺泡组织同样具有很大的破坏作用。两者的共作用，可以导致肺气肿的形成。

以往人们普遍认为吸烟通过一些理化因素，刺激巨噬细胞聚集于肺泡，从而增加肺泡巨噬细胞的含量。但从我们的实验结果看，烟雾中的某些成分，可以抑制巨噬细胞的凋亡，从而使肺泡巨噬细胞生存时间延长，导致肺泡巨噬细胞的增多。这一点在肺气肿的发病中的作用不能忽视。究竟烟雾中何种成分导致巨噬细胞凋亡减少，以及通过何种机制抑制巨噬细胞的凋亡，有待于进一步研究。

参考文献

［1］Finkelstein R,Fraser rS,Ghezzo H,et al Alveolar inflammation and its relation to emphysema in smokers［J］.Am j Respir Crit Care Med，1995,152(5 Pt 1):1666-1672.

［2］钟晓松,童善庆,张希衡,等.细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤药物敏感性并与MTT法的比较［J］.中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4(2):125-127.

［3］Hotz MA，Gong JP,Tragance F,et al Flow cytometric dection of apoptosis:comparison of the assays of in situ DNA degradation and chromatin changes［J］.Cytometry,1994,15(4):237-244.