【摘要】目的观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化，并研究超氧化物歧化酶(SOD)和Vit c对这种变化的影响。方法分离Wistar大鼠主动脉，并在PBS培育液中培养1小时，然后使其暴露于-20℃环境。以全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以Griess化学法观测血管NOS活力，以肾上腺素自氧化法测定血管SOD活力。结果当血管暴露于-20℃环境1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力的增强幅度和血管SOD活力的降低程度均逐步增大，表明血管分别相应受到轻、中、重度冷损伤；冷损伤后4小时，轻度冷损伤血管NOS活力较未冷冻血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则显著下降，分别达17.9%、29.6%。血管冷冻后立即给予SOD(200 u/ml)或Vit C(50 mg/ml)，可使冷损伤血管NOS活力分别较未经SOD或Vit c处理者显著升高，并降低了冷损伤血管培养液中LDH活力，使血管SOD活力回升。结论血管NOS活力降低是导致冷损伤组织血液循环障碍发生的重要原因；SOD及Vit c可通过调节提高血管NOS活力，防止或减缓机体冷损伤的发生。

Changes of NO synthase activity in the cold injured blood vessels and its biological significance

Qian Lingjia,Pan Ning,Wu xiaohong,et al.

institute of Health and Environmental Medicine,Academy of Military Medical sciences,Tianjin 300050

【Abstract】ObjectiveTo explore the new therapy by observing the changes of NO synthase(NOS) activity in the cold injured blood vessels and by studying the effects of SOD and Vit C on the changes of NOS activity.MethodsThe aortic artery was isolated from Wistar rats and cultured in PBS medium for 1 h,then exposed to -20 ℃ cold environment.LDH activity was measured using Biochemistry Automatic Analysis-Meter,NOS and SOD activities in blood vessels were analysed respectively by Griess assay and adrenalin autooxidation method.ResultsWhen the vessels were exposed to cold for 1,2,4 min respectively,LDH activity in the cultured medium increased and SOD activity in the vessels decreased at different level,indicating varying degree of vessel injury:slight-,moderate- and severe cold injury.After 4 h of cold exposure,NOS activity in the slight-,moderate- and severe-injured vessels increased by 15.3%,and decreased by 17.9%,29.6% respectively as compared with control.The changes of the NOS activity was time dependent.Treating with SOD(200 U/ml) or Vit C(50 mg/ml) immediatly after cold exposure made NOS and SOD activity in the vessels significantly increase and LDH in the medium decrease.ConclusionThe decrease of NOS activity may lead to the disorder in vascular circulation of cold injury,SOD and Vit C could prevent from or alleviate cold injury by increasing NOS activity.

【Key words】Cold injured blood vesselNO synthaseSODVit c

在寒区冬季作业和从事高山探险、极地考察的人群中，寒冷损伤经常发生。组织血液循环障碍是最终导致机体冷损伤的主要原因^［1］。血管内皮细胞是冷损伤过程中最先和最易损伤的部位，对冷致血管内皮细胞损伤的发生机制虽先后提出了自由基损伤学说、炎性介质介导学说、缺血再灌注诱导白细胞粘附学说等，但对冷损伤机体血液循环障碍的病理学本质至今未获得明确认识。近年来研究表明：血管内皮细胞产生的NO不但能舒张血管，而且有重要的细胞保护作用^［2，3］，是维持血液循环不可缺少的关键调节物质。我们通过观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化及抗氧化剂对这种变化的调控作用，进一步探索冷损伤的发病机制，为冷损伤的治疗开拓新的思路。

材料与方法

1.冷损伤血管模型的建立：选取200～250 g Wistar大白鼠80只，雌雄各半，分为10组：对照组和3种不同程度冷损伤组，而各冷损伤组根据冷损伤后给予或不给予超氧化物歧化酶(SOD)、Vit c再分为冷损伤组、冷损伤+SOD组、冷损伤+Vit C组。分离大鼠主动脉并置于血管培育液(PBS)中，同时将血管剪切为2～3 mm长的血管环，放在CO₂培养箱培养；冷损伤组血管在CO₂培养箱内培养1小时后，将血管培育管置于-20℃冰浴中。以低温温度计测得管中PBS温度达-20 ℃时开始记时，分别在1、2、4分钟时，取出培育管置于37℃水浴中10分钟；然后根据实验设计在血管培育液中分别加入(或不加)SOD(200 u/ml)或Vit C(50 mg/ml)，并将血管放在CO₂培养箱内继续培养一定时间后，取样进行有关指标测定。

2.实验方法：采用全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以观测血管冷损伤程度；采用Griess化学法以观察血管NOS活力^［4］；采用肾上腺素自氧化法测定血管SOD的活力；用Folin酚法测定血管蛋白含量。

3.统计学处理：数据以±s表示，采用t检验。

结果

1.不同冷冻强度对血管培养液中LDH活力的影响：当血管内皮细胞破损时，LDH就会释放到细胞外，因此细胞外LDH活力可作为对细胞完整性的监测指标。实验表明：当血管在-20℃环境暴露1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力较未冷冻血管显著升高，分别达125.6%、156.3%和184.2%(图1)，表明血管内皮细胞受到了明显破坏，血管受到了不同程度的冷损伤；将此3种冷冻条件所致血管冷损伤分别定义为：轻度、中度、重度血管冷损伤。

与对照组比较，^*P＜0.05;与冷暴露组比较，^＃P＜0.05^*P＜0.05 vs.control;^＃P＜0.05 vs.cold exposure

图1冷暴露血管培养液中LDH活力的变化(n=8)

Fig 1Changes of LDH activity in the culture medium

of blood vessels exposed to cold(n=8)

2.冷损伤血管NOS活力的变化：如图2所示，血管NOS活力因冷损伤程度相异而有不同的变化趋势：冷损伤后4小时，轻度冷损伤者NOS活力较未损伤血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则较对照显著下降，分别达17.9%、29.6%。冷损伤血管NOS活力变化具有明显的时间依赖性，不同程度冷损伤血管NOS活力的显著变化均始于冷损伤后4小时，随着冷损伤后时间的延长，这种变化的趋势持续存在(图3)。

与对照组比较，^*P＜0.05;与冷暴露组比较，^＃P＜0.05^*P＜0.05 vs.control;^＃P＜0.05 vs.cold exposure

图2冷暴露血管NO合成酶活力的变化(n=8)

Fig 2Changes of NOS activity in blood vessels

exposed to cold(n=8)

与对照组比较，^*P＜0.05^*P＜0.05 vs.control

图3冷暴露血管NO合成酶活力变化的时间依赖性(n=6)

Fig 3Time dependency of NOS activity in blood vessels

exposed to cold(n=6)

3.不同程度冷损伤血管SOD活力：对轻、中、重度冷损伤血管SOD活力的测定结果表明，SOD活力随冷损伤程度加重而逐步降低，分别为未损伤血管的89.4%、77.5%和68.4%(P＜0.05，图4)。

4.SOD和Vit C对冷损伤血管NOS活力变化的影响：当血管受到冷冻后立即分别给予SOD和Vit c，冷损伤血管NOS活力变化发生明显改变(图2)。SOD使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力分别较未给SOD者升高6.2%、10.8%和8.3%；Vit c则可使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力升高0.9%、3.6%和4.4%。

5.SOD和Vit C对冷损伤血管的保护作用：对不同强度冷冻血管给予SOD和Vit c后，血管培养液中LDH活力较未给予SOD或Vit C者显著降低(图1)；而冷损伤血管SOD活力较未给予SOD或Vit c者明显回升(图4)。对SOD和Vit C作用后冷损伤血管NOS活力和LDH活力变化的相关分析表明:两者之间呈显著负相关关系(r=-0.9561,P＜0.05)。

与对照组比较，^*P＜0.