【摘要】目的观察不同金属硫蛋白(MT)表达的水平与细胞耐寒力的关系。方法将质粒pBAcNeo-MTⅡ_A转染NIH3T3细胞，检测其在不同温度下的存活力。结果各细胞克隆的存活力随着温度的下降而下降，如细胞克隆Sneo(相对荧光强度1.3%)0 ℃时的吸光度(A值)较37 ℃时下降了0.529，但MT表达上调可提高细胞对低温的耐受性，MT含量越高对低温的耐受性越大，细胞克隆SMT1(29.4%)0 ℃时的A值较细胞克隆Sneo高约0.160，二者在统计学上差异有显著意义。细胞形态学上也得到了充分证实。结论MT表达上调对细胞耐寒力的提高有一定的积极作用。

Relationship between metallothionein and cold tolerance of cells

Gu Aimei,Dong Zhaoshen,Deng Xinzhu.

The Faculty of Military Health of the Fourth Military Medical University,Xian710032

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of different metallothionein(MT) expression levels on cold tolerance of cells.MethodNIH3T3 cells were transfected with plasmid pBAcNeo-MTⅡ_A.With the help of immunohistochemistry and flow cytometry,several cell clones which contained different MT levels were selected,their growth-rates were similar to each other.After exposure to 0 ℃,10 ℃,20 ℃ and 37 ℃ for 24 h,the survival rates were observed by MTT-test.ResultsThe cell survival rates decreased when the temperature was low.The survival rate(absorbance,A) of cell clone Sneo(the relative intensity of immunofluorescence of MT protein with pBAcNeo is 1.3%) at 0 ℃ decreased by 0.529 compared to 37 ℃.But the higher the MT protein level was,the less the cells damage in cold-stress.The survival rate of cell clone SMT1(the positive immunofluorescence of MT protein with plasmid pBAcNeo-MTⅡ_A is 29.4%) at 0 ℃ increased about 0.160 compared to cell clone Sneo.The morphological changes also supported the results.ConclusionUp-regulated MT protein in NIH3T3 cells could improve their cold-tolerance.

【Key words】Cold-toleranceTransfectionMetallothioneinNIH3T3 cells

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一种富含半胱氨酸的小分子质量的金属结合蛋白，相对分子质量约为6 000～7 000 Da，在生物界的各种组织中普遍存在，可在金属、细胞因子、物理、生理、病理等多种应激条件下诱导产生，具有对重金属的解毒、自由基的清除和应激的保护、储存运输和代谢金属等多种生物学功能，加之进化中其半胱氨酸残基位点在多肽链上的高度保守性，在维护机体内环境的稳定、抵御外环境的有害因素方面有非常重要的作用^［1，2］。文献报道：冷应激可诱导机体MT水平的增高^［3］。我们拟将人全长MT-Ⅱ_A基因转染NIH3T3细胞，观察不同MT表达水平与细胞耐寒力之间的关系。

材料与方法

1.实验材料：pBAcNeo和pBAcNeo-MTⅡ_A质粒由美国纽约医学院Dr.Peter J.Sciavolino惠赠；NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)购于中国医学科学院肿瘤研究所；HL-60(人早幼粒白血病细胞系)系第四军医大学西京医院血液科硕士梁蓉医师惠赠；DMEM和RPMI-1640培养基、限制性内切酶BamH I及酶切缓冲液(Buffer)购于GIBCO公司；MT单抗购于美国ZYMED公司；胰酶购于Sigma公司。

2.方法：(1)质粒的扩增和鉴定：按常规方法提取质粒DNA^［4］，并用限制性内切酶BamH I进行酶切鉴定。(2)Lipofectamine介导的MT-Ⅱ_A基因转染NIH3T3细胞：NIH3T3细胞系实验用150～160代，培养液DMEM含双抗及体积分数10%胎牛血清，体积分数5%CO₂、37 ℃培养。转染前调整细胞的状态和数量，由第二代脂质体Lipofectamine介导进行转染^［5］，转染16小时后换新鲜培养基。继续培养,传代后用G-418(300 μg/ml)进行筛选，直至亲本NIH3T3细胞全部被杀死，再继续培养形成单细胞克隆，分别挑取，扩大培养并命名为SMT1、SMT2、SMT3……，转染空载体的细胞经G-418筛选后混合培养，命名为细胞克隆Sneo。(3)免疫组化和流式细胞技术检测各细胞克隆MT的表达：免疫组化ABC法^［6］初筛各阳性细胞克隆，流式细胞技术进一步定量。(4)描述细胞克隆的生长曲线和细胞倍增时间(Td)：以T代表培养时间(h)，No及N分别代表接种后及培养T小时后细胞数，根据Patterson公式T_d =T×lg2/lg(N/No)计算细胞群体倍增时间。(5)低温对各细胞克隆存活力的影响测定——MTT法：采用析因分析设计，实验因素为2个，一个是MT的表达量(A因素)，共4个水平［1.3%(对照)、6.4%、10.4%、29.4%］；一个是培养的温度(B因素)，共4个水平［0、10、20、37 ℃(对照)］，4×4=16个处理组，每组每个细胞克隆重复8个孔。将其分别放于37、20、10和0 ℃的培养箱中，24小时后取出，MTT法测定各孔吸光度值(A)，λ=490 nm，在SPLAM上用析因分析处理。(6)形态学观察：将细胞克隆SMT1置于4 ℃冰箱中冷暴露24小时，体积分数0.25%胰酶消化，0.01 mol pH 7.4的PBS洗2次，2 000 r/s×10 min离心收集细胞，弃上清，以体积分数为3%、pH 7.4的戊二醛固定，按电镜标本常规制备方法进行固定、包埋、超薄切片，铅、铀染色，JEM-2000型电镜观察。以4 ℃下的细胞克隆Sneo为阴性对照。

结果

1.pBAcNeo-MTⅡ_A的限制性酶切鉴定：载体pBAc长约9 kb，含有部分PBR322片段，可在E coli中复制，并具有Amp抗性，早期SV40启动子驱动的E coli Neo基因使该质粒转染的细胞能在含G-418选择培养基上生长。它含有3个BamH I位点，酶切后电泳可见6.3、2.2、0.6 kb 3个片段；由β-Actin启动子将人全长MT-Ⅱ_A cDNA(0.4 kb)克隆在pBAcNeo质粒上，经BamHI酶切，电泳可见6.3、2.2、1.0 kb3个片段(图1)，与构建片段相吻合。

2.转染实验的筛选结果：HL-60细胞用MT单抗检测为胞浆胞核强阳性。野生型NIH3T3细胞的MT含量很低，仅为0.1 μg/mg 蛋白^［7］，在本实验中免疫组化ABC法染色为阴性，在流式细胞仪上测得其相对荧光强度1.8%，转染空载体的细胞克隆Sneo亦如此，相对荧光强度1.3%。SMT1、SMT27、SMT25都为阳性克隆，ABC法染色胞浆呈棕黄色，胞核不着色，形态呈戒指状，流式细胞检测其相对荧光强度为29.4%、10.4%、和6.4%。

泳道1pBAcNeo BamH I酶切DNA片段； 泳道2DNA Marker λ Hind Ⅲ； 泳道3质粒 pBAcNeo； 泳道4pBAcNeo/MT-Ⅱ_A BamH I酶切DNA片段； 泳道5DNA Marker λ Hind Ⅲ； 泳道6质粒 pBAcNeo/MT-Ⅱ_A

Lane 1Digestion of pBAcNeo with BamH I； Lane 2Marker λ DNA/Hind Ⅲ； Lane 3pBAcNeo plasmid； Lane 4Digestion of pBAcNeo/MT-Ⅱ_A with BamH I； Lane 5Marker λ DNA/Hind Ⅲ； Lane 6pBAcNeo/MT-Ⅱ_A plasmid

图1BamH I电泳鉴定pBAcNeo-MT Ⅱ_A

Fig 1Digestion of pBAcNeo-MT Ⅱ_A with

3.细胞基本生长特性分析：从所绘制的生长曲线中可看出，转染MT的细胞克隆与阴性细胞克隆、亲本NIH3T3细胞的生长状况无明显差异，对数生长期同在第2～7天，第8天进入平台期。细胞克隆3T3、Neo、SMT1、SMT27的群体倍增时间分别为15.15、15.83、17.50、16.33小时。

4.低温下细胞存活力实验：(1)MTT实验结果：由表1可看出，在37 ℃时转染空载体的细胞克隆Sneo与阳性细胞克隆SMT1、SMT27、SMT25的存活力相近，相互之间差异无显著性，与生长曲线描述的一致。低于37 ℃时，各个细胞克隆的存活力随温度的下降而下降，大致顺序是：37 ℃＞20 ℃＞10 ℃、0 ℃(P＜0.05)。另外，MT表达水平不同，对低温的耐受性也不同，MT水平越高，细胞存活力受影响越小，对低温的耐受性也越大。在20 ℃时，SMT1的A值是Sneo的2倍，二者之间差异有显著性(P＜0.01)，SMT27的存活力次之(P＜0.05)，而SMT25与Sneo的存活力差别不太明显。在10 ℃、0 ℃时，只有SMT1的存活力显著高于Sneo，而SMT27、SMT25的存活力虽有所提高，但统计学意义不大(P＞0.05)。(2)形态学观察：经过4 ℃24小时的冷暴露，在电镜下可看到，转染MT基因的细胞克隆SMT1普遍发生了较轻微的病理变化，如线粒体轻度肿胀，嵴排列疏松紊乱、有些溶解，内质网稍有扩张，胞膜完整，核糖体含量丰富(图2)；未转染MT基因的细胞克隆Sneo组病理改变明显，多数细胞肿胀变大，线粒体明显肿胀，嵴排列紊乱、溶解消失，内质网高度扩张成池状，空泡样变，脂肪滴增多，核糖体减少，胞核不规则，染色体分布均匀，少量异染色质浓缩边集(图3)。形态学观察表明：MT表达上调对低温有一定的保护作用，可以增强细胞的抗寒力。