［摘要］目的探讨NADH-细胞色素b₅还原酶（b₅R）在散发性甲状腺肿发病中作用。方法应用荧光分析等技术测定甲状腺b₅R活性和H₂O₂浓度，用b₅R抑制剂观察b₅R活性变化对H₂O₂浓度和蛋白结合碘（PBI）形成影响。结果甲状腺H₂O₂浓度和PBI形成随b₅R活性降低而减少，抑制b₅R活性可抑制H₂O₂和PBI的形成。H₂O₂酶可明显减少PBI形成，而葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统可增加PBI形成。结论b₅R参与甲状腺H₂O₂生成，b₅R活性缺乏在散发性甲状腺肿发病中可能起重要作用。

［中图分类号］R581.1［文献标识码］ B

［文章编号］1000-4955(2000)04-301-03

Effect of NADH-cytochrome b₅ reductase in the pathogenesis of sporadic goiter

HUANG Guo-liang, LIN Feng,GAO Yan

(Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

Abstract： ObjectiveTo investigate the effect of NADH-cytochrome b₅ reductase (b₅R) in the pathogenesis of sporadic goiter.MethodsThe activity of b₅R and the levels of H₂O₂ in thyroid were measured with potassium ferricyanide as substrate and with the homovanillic acid fluorescence assay,the effect of change of b₅R activity on the levels of H₂O₂ and formation of protein-bound iodine (PBI) were observed by the addition of b₅R inhibitor.ResultsThe levels of H₂O₂ and PBI formation decreased with b₅R activity decreasing,inhibition of b₅R activity could inhibit generation of H₂O₂ and PBI formation.Catalase reduced PBI formation and glucose/glucose oxidase system increased PBI formation.Conclusionsb₅R participates in generation of H₂O₂,deficient b₅R activity may play an important role in pathogenesis of sporadic goiter.

Key words：NADH-cytochrome b₅ reductase; Sporadic goiter; Thyroid hormone synthesis; Hydrogen peroxide

散发性甲状腺肿又称非地方性甲状腺肿，其病因与地方性甲状腺肿不同，主要是由于甲状腺内在缺陷导致甲状腺激素合成和分泌障碍所致。甲状腺激素的合成需要碘，也需要过氧化氢（H₂O₂），H₂O₂缺乏将导致甲状腺激素合成障碍^［1，2］。NADH-细胞色素b₅还原酶（b₅R）被认为是甲状腺内产生H₂O₂的主要酶系^［3］。因此，b₅R在散发性甲状腺肿发病中可能有重要作用。我们应用高香草酸荧光分析等技术直接测定甲状腺H₂O₂水平和b₅R活性，同时建立碘有机化系统，应用b₅R抑制剂对氯汞苯甲酸（PCMB）观察b₅R活性变化对H₂O₂水平和蛋白结合碘（PBI）形成的影响，探讨b₅R在散发性甲状腺肿发病中作用。

1材料与方法

1.1对象手术治疗的甲状腺腺瘤15例，男性4例，女性11例，平均年龄(34.2±9.2)岁，手术时取其远离腺瘤的正常甲状腺组织。全部病例均经病理证实。

1.2b₅R活性测定按Kusakabe法^［1］，甲状腺匀浆在4℃下经低(3 000 r/min)、中(10 000 r/min)、高(13 000 r/min)速离心分离微粒体。按俞氏方法^［4］，以高铁氰化钾为底物，NADH为辅酶测定b₅R活性。以每min转化1 μmol底物的酶量为1个酶单位。为观察b₅R抑制剂PCMB对b₅R活性影响，加0.5 mmol/L PCMB预孵育5 min再测b₅R活性。

1.3H₂O₂测定参考Raspe法^［5］，反应体系中无荧光的高香草酸在H₂O₂和辣根过氧化物酶存在下转化为有很强荧光的高香草酸衍生物（2，2′-dihydroxy-3,3′-dimethoxybiphenyl-5,5′-diacetic acid）。以已知量H₂O₂为标准曲线，用RF-5301 PC型荧光分光光度计（日本岛津）测定。

1.4PBI测定参考Kusakabe法^［1］建立碘有机化系统，甲状腺匀浆在含KI、Na¹³¹I、NaCl、磷酸盐缓冲液等，pH 7.4的碘有机化系统37℃孵育2h,加20％三氯醋酸终止碘化反应，离心测沉淀物PBI放射性脉冲，加0.5 mmol/L PCMB或0.01％ H₂O₂酶或加1 mmol/L NaN₃及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统观察对PBI形成的影响。结果以pmol/mg组织表示。

1.5H₂O₂酶测定H₂O₂酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，以每mg组织中H₂O₂酶每min分解吸光度为0.50的H₂O₂相对量为1个单位。蛋白质定量采用改进的Lowry(1951)法。

1.6统计学分析方法2组间均数比较用非配对t检验，2个变量间关系用直线相关分析，结果用±s表示。

2结果

2.1b₅R活性和甲状腺H₂O₂及PBI形成关系正常甲状腺b₅R活性和H₂O₂水平分别为（252.7±46.2） U/g组织和（0.62±0.11) nmol·min^-1.mg^-1蛋白质，在碘有机化系统形成的PBI为（15.6±1.8) pmol/mg组织，加b₅R抑制剂PCMB后，b₅R活性下降至（32.7±6.2) U/g组织，明显降低（P＜0.05），降低87％；同时H₂O₂水平也明显降低，降至(0.29±0.05) nmol·min^-1.mg^-1蛋白质，下降53.2％（P＜0.05）；随H₂O₂降低，PBI亦从（15.6±1.8) pmol/mg组织降至（7.6±0.8) pmol/mg组织，减少51.3％（P＜0.05）。表明H₂O₂水平随b₅R活性降低而下降，而PBI形成则随H₂O₂水平下降而减少。但甲状腺H₂O₂酶活性加PCMB前为（9.80±2.76) U/g组织，加PCMB后为（9.52±2.37) U/g组织，二者无明显改变（P＞0.05）。

2.2H₂O₂对碘有机化影响在碘有机化系统，正常甲状腺形成的PBI为（15.6±1.8) pmol/mg组织，加H₂O₂酶后，H₂O₂水平从（0.62±0.1) nmol·min^-1.mg^-1蛋白质迅速降至（0.11±0.04) nmol·min^-1.mg^-1蛋白质，降低82.3％（P＜0.05），随H₂O₂降低，PBI的形成亦明显下降，降至(3.0±0.4) pmol/mg组织，下降80.6%(P＜0.05)。再加NaN₃及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统则H₂O₂水平升到(0.79±0.15) nmol·min^-1.mg^-1蛋白质，PBI也上升至(17.2±2.1) pmol/mg组织，恢复到正常水平。

2.3b₅R活性与H₂O₂水平和PBI相关性将未加H₂O₂酶及葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统的甲状腺b₅R与H₂O₂水平及PBI进行相关分析，结果b₅R活性与H₂O₂水平及PBI均呈显著正相关关系（r分别为0.7217、0.6274，P＜0.05）。

3讨论

缺碘为地方性甲状腺肿的主要病因，这已被人们所接受，而散发性甲状腺肿与地方性甲状腺肿不同，主要是由于甲状腺内在缺陷致甲状腺激素合成和分泌障碍所致。甲状腺激素的生物合成除需要碘外，也需要H₂O₂，H₂O₂和碘一样都是甲状腺激素合成所需的重要成份，缺少H₂O₂即使有足够的碘，其碘离子也不能氧化成活性碘，酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的偶联也无法进行。因此，甲状腺内缺少H₂O₂，其结果和缺碘相似，都可引起甲状腺激素合成障碍。b₅R是甲状腺内产生H₂O₂的主要酶系^［3］，b₅R活性缺乏将导致H₂O₂生成不足，甲状腺激素合成障碍。因此，b₅R在甲状腺激素生物合成中有重要作用，可能与散发性甲状腺肿有密切关系。

为了阐明b₅R与H₂O₂之间关系，我们以高铁氰化钾为底物测定b₅R活性，同时应用高香草酸荧光分析技术直接测定H₂O₂浓度。结果H₂O₂浓度与b_5<