［摘要］目的为进一步探讨低硒与心肌损伤的关系，以及细胞凋亡是否参与心肌损伤及其机制。方法用低硒合成饲料喂养昆明鼠，五周后交配，取其子代3周龄乳鼠心肌组织，采用TUNEL法、透射电镜及免疫组化法等技术检测凋亡细胞及其相关基因。结果低硒乳鼠心肌细胞有凋亡现象存在，而补硒组却未见类似现象。结论低硒可以引起子代乳鼠心肌细胞发生凋亡。

［中图分类号］R542.3;O613.52［文献标识码］［文章编号］1000-4955(1999)06-0422-03

Experimental research on the apoptosis of young mice′s myocardium induced by low selenium

ZHOU Ling-wang,ZHONG Xue-kuan,GAO Yan-hui,et al

(Research Institute of Keshan Disease of Harbin Medical University 150086,China)

［Abstract］ObjectiveTo further investigate the relationship between low-selenium and myocardium lesion and study whether the apoptosis is related with the injury of lesion and myocardium and what the mechanisms are.MethodsThe original Kunming mich were provided with low-selenium feed and mated after five weeks.Then the three-week young mice's hearts were collected as experimental materials to examining apoptosis and it's related gene expression by using TUNEL,electromicroscope and immunohistochemistry methods.ResultsThe apoptosis cells were found in the low-selenium mice's myocardium.There was no apoptosis in the rich selenium mice's myocardium.ConclusionsThe deficiency of selenium can lead to apoptosis of the young mice's myocardial cells.

［Key words］Keshan disease;Low selenium;Myocardium lesion;Apotosis

硒是一种人体所必需的微量元素，在机体内多以硒代半胱氨酸形式存在，并且是数种具有重要生物学功能的含硒酶的必要组成部分，成为酶的催化中心。多年来，人们对低硒导致机体抗氧化能力下降，从而引起生物膜的结构和功能改变已有不少报道^［1～3］。正常情况下，细胞凋亡是机体为维持其平衡的一种主动生物学过程，与一系列基因被激活、表达有关。一旦调控失常，则该机制参与多种疾病的发生与发展。克山病发生于低硒地区，其尸检心肌组织中存在细胞凋亡现象^［4］，而低硒与心肌细胞凋亡间的关系未见有报道，为探讨低硒是否能直接导致心肌细胞凋亡，本实验采用人工合成低硒饲料喂养昆明鼠，取其子代乳鼠20只心肌组织进行细胞凋亡及其相关基因表达产物的检测，以进一步探讨低硒对心肌细胞损伤间的作用机制。

1材料与方法

1.1低硒饲料配比（％）低硒酵母45，猪油4，色拉油1，无硒盐3.5，无V-E的混合维生素1，氯化胆碱0.1，DL蛋氨酸0.3，砂糖加至100，加VE36.6mg/kg。硒含量0.016mg/kg，蛋白含量21％，VE含量41mg/kg。

1.2标本制备实验用昆明鼠购自北京协和医科大学实验动物中心，购回后先喂养一周常规饲料，然后换用低硒饲料喂养5周，常硒对照组饮用含硒0.3mg/L的水。实验组母鼠经微量全血谷胱苷肽过氧化物酶（GSH-px）测定，证实达到低硒状态后进行交配，并继续饲以低硒饲料，取其子代3周龄乳鼠20只心肌组织进行多聚甲醛固定、常规脱水、透明、包埋、切片。

1.3GSH-px测定按荣征星等微量全血法进行^［5］。

1.4TUNEL (TDT-mediated dUTP nick end labeling)法测定凋亡细胞采用德国B.M公司试剂盒（批号84157920-10），实验按操作说明进行。

1.5免疫组化法检测凋亡相关基因产物C-myc、Bcl-2单克隆和多克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司（产品编号C-33，N-19），按S-P法作免疫组化常规染色。

1.6常规光镜病理制片及观察。

1.7常规透射电镜作细胞超微结构观察。

2结果

2.1GSH-px检测结果低硒实验组母鼠为1.97±0.66U/μl.min，常硒对照组母鼠为3.99±0.58U/μl/min。证明实验组母鼠处于低硒状态，可作为实验组传代用母鼠；实验时，低硒乳鼠为1.28±0.25,常硒乳鼠为3.13±0.22。

2.2TUNEL法检测细胞凋亡结果低硒实验组小鼠心肌组织内可见散在分布、核被染成棕褐色的凋亡细胞，多见于心内膜下心肌组织。而常硒对照组未见有细胞凋亡。

2.3C-myc基因产物检测结果低硒实验组心肌组织可检出核膜呈棕褐色的C-myc基因表达产物。而常硒对照组确未见此现象。

2.4Bcl-2基因产物检测结果常硒对照组心肌组织可检出胞浆被染成棕褐色的Bcl-2基因表达产物，而低硒实验组中很少见此现象，并且染色也较浅。

2.5心肌组织光镜观察结果低硒实验组及常硒对照小鼠均未发现明显的病理改变。

2.6心肌细胞超微结果观察实验组心肌电镜下可见细胞核变小、染色质浓缩、边集、呈环状或半月状，甚至凝集成团块状等凋亡细胞所特有病理改变，同时除可见部分线粒体肿胀外未见基它细胞器有明显病理改变。

3讨论

硒是人体必需的微量元素，是具有重要生物活性作用的含硒酶的主要组分。如Se-GSH-px是一种有效的抗氧化酶。目前认为，生物膜中磷质的多稀不饱和脂肪酸（PUFA）的脂质过氧化是造成组织损伤的主要原因，而Se-GSH-px能防止过氧化物和自由基的形成，从而阻断脂质过氧化的链式反应，稳定生物膜的流动性和弹性，保持生物膜的结构与功能的完善。本实验通过8周低硒饲养制备低硒子代鼠模型，经GSH-px测定达低硒状态。

细胞凋亡是细胞死亡的一种特殊类型，正常情况下是机体为维持自身稳定的一种生理行为，该机制受多种基因调控，一旦该机制失常将参于多种疾病的发生与发展^［6］。C-myc为一调节凋亡的双向基因，在去除生长因子条件下可诱导细胞凋亡。Bcl-2为凋亡信号传递过程中的一个阻断因子。本实验结果显示，低硒实验组乳鼠心肌组织中存在较多的凋亡细胞，并同时伴有C-myc基因的高表达，而Bcl-2蛋白呈限定性区域分布，这两项凋亡相关基因蛋白检测结果与上述心肌细胞凋亡的检出呈相关趋势。同时电镜结果也证实心肌细胞核变小，染色质浓缩、边集甚至凝集成团块状等细胞凋亡所特有的病理改变。而上述改变在常硒对照组却未发现。心肌细胞为终末分化细胞，心肌细胞的凋亡意味着病理过程的发生。本实验在低硒乳鼠心肌组织中检出凋亡细胞，而常规光镜观察确未见低硒实验鼠心肌有明显的病理改变，我们认为这种凋亡现象可能是低硒状态下乳鼠心肌细胞早期损伤的一种表现，或心肌组织处于某种应激状态。一旦在某种特定因子（内源性或外源性）激发下，使心肌组织可能出现明显的病理改变。这一观点尚有待于进一步的实验证实。

克山病多发于低硒地区^［7］，补硒预防克山病收到了一定的效果^［8～10］。因而低硒作为克山病发病的条件因素被普遍认可。由于病区人群长期处于低硒环境中，体内Se-GSH-px含量显著不足，致使机体抗氧化能力下降，心肌尤为明显^［11］，氧自由基、脂质过氧化产物堆积，导致机体的膜系统氧化损伤，心肌线粒体更为明显^［12］，本实验在电镜下可见心肌线粒体肿胀的病理改变以及Bcl-2基因表达降低，Bcl-2主要是与线粒体膜结合后才能发挥其阻断凋亡效应，并还有直接的抗氧自由基作用^{［13，14］}。另外，由于膜的脂质及膜蛋白受氧化损伤，使钙代谢机制崩溃，钙离子内流，导致细胞内钙离子浓度升高^{［15，16］}。氧自由基及高浓度的钙离子可激活核酸内切酶，使DNA核小体连接部分出现断裂，呈现细胞凋亡。

本实验以长期低硒饮食为条件，观察到子代乳鼠心肌细胞存在凋亡现象。并以低硒引起机体抗氧化能力低下为背景，初步探讨了低硒引起心肌细胞凋亡的发生机制,而其在克山病发病机理中的作用还有待于进一步的实验论证。

参考文献

［1］Xia Y,Hill KE and Burk RF.Biochemical studies of a seleniumdeficient population in China:Measuremant of selenium,glutathione peroxidase and other oxidant defense indices in blood［J］.J,Nutr,1989,119:1318-1326.

［2］杨志伟，杨法军，忻文娟，等.四拮抗超氧阴离子导致的心肌线粒体膜损伤［J］.生物物理学报.1994，10（1）：63-67.

［3］杨志伟，杨法军，忻文娟，等.羟自由基对心肌线粒体膜的影响及硒的效应［J］.生物物理学报.1994，10（2）：305-310.

［4］钟学宽，于波，张邻杰，等.克山病心肌损伤与细胞凋亡［J］.中国地方病学杂志，1997，16（2）：81-82.

［5］荣征星，刘慧中，鲍景奇，等.小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶活力的微量