【摘要】目的探讨构建柯萨奇病毒B组3型（CVB3）基因疫苗的可行性。方法应用逆转录PCR技术扩增CVB3中国分离株VP1基因，通过TA克隆法构建pCR2.1-CVB3VP1,将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,并进行酶切和测序鉴定。结果发现CVB3的中国分离株与Nancy株的VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，其中有59处核苷酸存在变异,但仅改变了10处氨基酸编码，证实克隆的片段为CVB3VP1基因，表达载体为pCEP4。结论实验成功地构建了CVB3中国分离株的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,为CVB3基因疫苗的研究奠定了基础。

分类号：R373.23文献标识码：A论文编号：1000-4955(1999)03-0169-72

Clone of eukaryotic expression system for VP1 gene of Coxsackieviru s group B type 3 Chinese strain

TIAN Ye,ZHONG Zhaohua,ZHAO Tieqiang,et al.

Department of Cardiology,First Clinical Medical College of Harbin Me dical University,Harbin 150001

【Abstract】ObjectiveTo construct the gene vaccine of Coxsackievirus group B type 3(CVB3).MethodsThe VP1 gene of CVB3 Chinese strain was amplifi ed by means of reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) and pCR2.1- CVB3VP1 was constructed by TA cloning strategy.The newly eukaryotic expression s ystem pCEP4-CVB3VP1 was constructed by subcloning,and confirmed by restrict anal ysis and sequencing.ResultsThe VP1 gene of CVB3 Chinese strain has 59 base s differences from that of CVB₃ Nancy strain,some of them cause only 10 amino acid changes and others are nonsense mutations.ConclusionsOur results may be useful for research of C VB3 immunological characteristics.

【Key words】Coxsackievirus group B type3VP1 geneEukaryotic expression system

柯萨奇病毒B组（CVB）有6个血清型（CVB1～6），是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原，近年来的发病呈上升趋势，目前尚缺乏有效防治手段，基因疫苗（Gene vaccine）为病毒感染的防治开辟了新的途径^［1］。本研究拟克隆编码CVB3中国分离株主要中和抗原的VP1基因^［2］，构建其真核表达系统，为CVB基因疫苗的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1实验材料CVB3毒株为中国分离株，由哈尔滨医科大学微生物学教研室保存，病毒在Vero细胞传代，TCID50为10^-8。TA克隆载体pCR2.1和真核表达载体pCEP4均为Invitrogen产品，宿主菌株为JM109。质粒提纯试剂为Promega公司的WizardM inipreps Plasmid Purification Kit。

1.2CVB3 VP1的扩增按文献方法进行^［3］。自行设计PCR引物，上游5′-AGG AAT TCA TGG AAG ACG CGA TAA C-3′，下游为5′-TGT CTA GAT GCGT TTG CCT AGT AGT G-3′。PCR循环：94℃30sec、60℃45sec、72℃1min,共35个循环，最后一次延伸7min。取10μl扩增产物上1％琼脂糖凝胶电泳。

1.3pCR2.1-CVB3VP1的构建电泳后回收0.83kb片段，取约0.1μg/μl VP1 DNA0.3μg与0.05μg线状pCR2.1在T4DNA连接酶作用下4℃反应16h。转化JM105，接种至含氨苄青霉素的SOB平板，37℃培养18～24小时。

1.4pCR2.1-CVB3VP1的筛选和鉴定从转化菌平板中任选20个菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养6h，取1ml菌粗提质粒，电泳检查重组子的大小。培养经初步筛选的细菌，取1.5ml细胞提取质粒，参照Ausubel^［3］等的方法略加修改。将提取的pCR2.1—CVB3VP1用XbaI和XbaI+EcoRI消化，电泳观察质粒的酶位点并判定片段插入方向。

1.5pCEP4-CVB3VP1的构建将pCEP4-CVB3VP1和pCEP4分别用BamHI和XhoI酶切消化，获得两个互补粘端，取pCEP4-CVB3VP1/BamHI+XhoI3μl和pCEP4/BamHI+XhoI2μl加至0.5ml微量离心管中，参照文献Ausubel等^［3］的方法进行连接反应和转化实验。

1.6pCEP4-CVB3VP1的筛选和鉴定粗提转化菌落，电泳观察重组质粒大小，选择可能转化的菌落提纯质粒。经EcoRI、XbaI等酶切，判断重组子酶切位点和目的基因插入方向。

1.7DNA序列测定小量提纯pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1，两次酚：氯仿抽提，使A260/A280介于1.8至1.9间，将浓度调整至0.2μg/μl，测序委托美国CyberSyn公司进行。pCR2.1-CVB3VP1的测序引物选用M13forward primer(20)和M13 reverse primer,pCEP4的测序引物为5′-ACC TCC CCC TGA ACC TGA AA-3′,pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向正确与否，因此只测一侧序列。

2结果

2.1CVB3 VP1的扩增、克隆VP1基因PCR扩增产物电泳结果见图1。在0.83kb处可见一条明亮的核酸区带，与理论预期值一致。

图1CVB3VP1基因扩增结果

A：λDNA/HindⅢ

B：CVB3VP1(0.83kb)

2.2pCR2.1-CVB3VP1的构建与鉴定CVB3VP1片段与pCR2.1连接产物转化JM105后获得约300个菌落，JM105菌平板和线状pCR2.1转化平板均无细菌生长。结果表明pCR2.1-CVB3VP1转化子带有重组质粒。电泳检查发现重组质粒大小均在4.7kb左右。提纯质粒，pCR2.1-CVB3VP1用XbaI消化获得3.9kb和0.83kb两个片段，初步说明该质粒确为目的克隆。经XbaI+EcoRI酶消化后获得3.9kb、0.5kb、0.3kb三个片段，说明VP1插入方向为反向（见图2，3）。

图2pCR2.1-CVB3VP1经XbaI酶切后电泳图谱

A:ΦX174/HaeⅢ；

B：λDNA/EcoRI+HindⅢ；

C：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI

图3pCR2.1-CVB3VP1经EcoRI和XbaI酶切后电泳图谱

A:λDNA/EcoRI+HindⅢ；

B：ΦX174/HaeⅢ；

C：pCR2.1-CVB3VP1/EcoRI+XbaI

2.3pCEP4-CVB3VP1的构建与鉴定pCEP4-CVB3VP1转化JM109经过夜培养后可见约150个菌落，而pCEP4未切质料转化JM109平板长满菌落，pCEP4/BamHI+XhoI转化和JM109感受态菌对照均无菌落，说明转化结果良好。粗提质粒，电泳观察重组质粒大小约11kb，与理论预期值一致。进一步提纯质粒，经EcoRI酶消化可切成4.88kb、2.48kb、2.48kb、0.60kb、0.39kb、0.30kb六个片段。经XbaI消化可切成10.0kb、0.83kb、0.46kb三个片段。初步证明重组质粒为携带CVB3VP1片段的pCEP4，且插入方向正确（见图4）。

图4pCEP4-CVB3VP1用EcoRI,XbaI酶切结果

A：λDNA/EcoRI+HindⅢ；

B：pCEP4-CVB3VP1/EcoRI；

C：pCEP4-CVB3VP1/XbaI；

D：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI；

E:pCEP4未切质粒

2.4DNA序列测定测序结果经PlasmidPrimier2.02软件分析。pCR2.1-CVB3VP1测序结果显示克隆的基因确为VP1基因，CVB3中国分离株VP1与CVB3Nancy株VP1之间存在59处核苷酸变异,大多数都发生在三联密码的第三个碱基，未影响到氨基酸的编码，只有10处氨基酸编码发生了变异。pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向，因此只测一侧序列。结果证明CVB3VP1以正确的方向克隆在pCEP4上。

3讨论

本研究所用的CVB3VP1引物是根据Klump等^［4］报道的CVB3Nancy株基因序列设计的，经实验证明该引物具有很好的特异性。TaqDNA聚合酶在扩增结束时一般在末端加A，利用这个特性，将扩增片段克隆到pCR2.1载体的TA克隆位点上。

序列资料显示的CVB3中国株VP1基因与Klump等^［4］报道的CVB3Nancy株VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，但二者间存在变异,比较二者发现有59个碱基不一致，其中10处发生了氨基酸编码的改变。不同作者报道的CVB3基因组核苷酸全序列均存在差异^{［2，4，5］}，原因可能是病毒RNA的扩增差异、测序错误<