【摘要】目的探讨细胞凋亡及结构蛋白Desmin异常表达与亚急型、慢型克山病的关系。方法应用原位末端标记法（TUNEL）及免疫组化技术在亚急型和慢型克山病患者心肌石蜡包埋组织切片上进行细胞凋亡及Desmin双重荧光染色，并应用共聚焦显微镜观察结果。结果克山病患者心肌组织中可见结构蛋白Desmin的异常荧光染色及细胞凋亡，有Desmin荧光染色变浅甚至消失，慢型克山病多表现为染色增强，或呈团状聚集于心肌细胞中间，或呈块状附于细胞膜下。凋亡细胞多见于有Desmin异常改变的心肌细胞、浸润的炎细胞、血管内皮细胞及一些间质细胞。结论细胞凋亡与结构蛋白Desmin异常参与克山病的发生与发展。

分类号：R542.3文献标识码：A论文编号：1000-4955(1999)02-0081—83

The research about abnormal expression of structure protein Desmin and apoptosis in heart tissue of Keshan disease

QIAN Sujuan,YU Weihan,YU Zuxi,et al

Keshan Disease Institute of Harbin Medical University,Harbin 150086

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between subacute and chronic Keshan disease and abnormal expression of structure protein Desmin and apoptosis.MethodsThe double flourescent staining of apoptosis and Desmin was examined in heart tissue of Keshan disease by immunohistochemical and TUNEL,and the confocal microscope was used to observe the results.ResultsIn heart tissue of Keshan disease were showed apoptosis and abnormal fluorescent staining of Desmin,which distributed around the focus.There were precedence of the weak or disappear of positive staining of Desmin in the heart tissue of subacute Keshan disease.The high staining was usually shown in the tissue of chronic Keshan disease.Whereas,or there was it in the center of myocyte,or under the membrane likes the block.A lot of apoptosis distributed in the myocyte with abnormal staining of Desmin,inflammatory cells,vascular endotheliocyte cells and interstitial cells of Leydig.ConclusionsApoptosis and abnormal expression of structure protein Desmin involved in occurrence and development of Keshan desease.

【Key words】Kashan diseaseDesminApoptosis

克山病（Keshan didease）是一种独立的病因不明的地方性心肌病，虽然近年来其发病率明显下降，但仍偶见克山病的散发，尤其是西南病区。近年，有关细胞凋亡及结构蛋白的研究成为生命科学的研究热点，已经发现多种心血管疾病与细胞内特种结构蛋白异常有关，如心肌缺血、限制型心肌病及肥厚型心肌病时发现有Desmin的异常^[1,2]。而凋亡作为一种特殊的细胞自发性死亡的方式参与许多疾病的发生与发展。本实验通过对亚急型及慢型克山病患者心肌组织进行细胞凋亡（Apoptosis）和结构蛋白Desmin双重荧光染色，并应用特异、敏感、先进的共聚焦显微镜观察结果，以探讨克山病的发病机制。

1材料与方法

1.1实验标本亚急型（7例）及慢型克山病人（8例）尸检左室心肌经10％福尔马林固定、石蜡包埋，组织块由哈尔滨医科大学克山病研究所提供，病人年龄42～60岁。非疾病意外死亡正常人尸检心肌组织5例，年龄32～56岁。

1.2常规组织形态学观察心肌组织切片（5μm）常规脱蜡、水化、苏木精和伊红（hematoxylin and eosin）染色、脱水、透明、封片后，于光学显微镜下观察结果。

1.3免疫组化及细胞凋亡双重荧光染色原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞试剂盒由ONCOR公司生产，阳性染色为红色荧光。鼠抗人Desmin单克隆抗体由DACO公司生产。FITC标记的马抗鼠第二抗体由VECTOR公司生产，阳性染色为绿色荧光。DAPI由SIGMA公司生产，阳性染色为蓝色荧光。

操作步骤：

（1）石蜡切片常规脱蜡、水化。

（2）0.04％胃蛋白酶盐酸溶液（0.01mol/L HCl pH3）于37℃修复抗原30分钟。

（3）加平衡缓冲液反应5分钟。

（4）与工作浓度的TdT酶于37℃反应1小时后，加终止反应液室温10分钟。

（5）加工作浓度的rhodamine标记的抗地高辛抗体于室温反应30分钟。

（6）与5％正常马封闭血清室温反应30分钟。

（7）加鼠抗人Desmin抗体（工作浓度20μg/ml）于4℃过夜。

（8）加FITC标记的马抗鼠第二抗体（工作浓度10μg/ml）室温反应2小时。

（9）DAPI复染（工作浓度1.0μg/ml）。

以上每一步结束需用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗3次，每次5分钟。

（10）VECTASHIELD (VECTOR Lab)封片后，于LEICA TCS-4D共聚焦显微镜下观察结果。

2结果

2.1HE染色正常成人心肌组织未见异常改变。亚急型克山病人左心室组织呈现弥漫性心肌细胞变性及灶状坏死，坏死灶内可见浸润的炎性细胞及纤维化表现，病变主要分布于血管周围，且心室壁内、中层病变重于外层。慢型克山病左心室组织病变以灶状的纤维瘢痕为主，炎性反应较轻，分布特点与亚急型相同。

2.2Desmin的检测于正常成人心肌组织中可见均匀、一致的Desmin阳性荧光染色，该染色呈带状分布于心肌细胞的Z线及闰盘，排列规则，染色清晰（见图1）。

绿色：Desmin蛋白阳性染色（FITC）；

红色，细胞凋亡阳性染色（Rhodamine）；

蓝色：细胞核复染（DAPI）

1正常人心肌组织Desmin呈规则带状分布，闰盘亦呈阳性反应（箭头）（×600）

克山病人心肌组织中，除心外膜下部分心肌细胞的Desmin呈现基本正常染色体外，大部分表现为异常染色，且离病灶越近，异常改变越明显，并与病变程度呈正相关。其异常改变可分为两类：①心肌细胞Desmin染色变浅甚至消失。这种改变在亚急型克山病时比较多见。②心肌细胞Desmin染色增强，失去正常带状结构，排列紊乱，或呈团状聚集于细胞浆中，或呈块状附于细胞膜下。这种改变在慢型克山病时多见。

2.3细胞凋亡检测于正常成人心肌组织中，可见散在的凋亡细胞，主要见于病灶内浸润的炎细胞、间质细胞、血管内皮细胞及病灶周围的一些心肌细胞（见图2）。慢型克山病时，凋亡细胞较少。通过双重染色发现，凋亡的心肌细胞主要分布于有Desmin改变的细胞（见图3）。

2亚急型克山病人心组织部分心肌细胞Desmin染色脱失，可见心肌细胞、间质细胞及血管内皮细胞凋亡（×400）

3慢型克山病人心肌组织Desmin凝聚及脱失，可见细胞凋亡发生于有Desmin改变的心肌（×400）

3讨论

Desmin是一种分子量为55KD的多肽，是正常人心肌及骨骼肌细胞中的结构蛋白，常与心肌中间纤维（intermediate filaments）相伴，分布于Z线与闰盘（intercalated disc），其功能是保证肌纤维向一定方向协调运动。Desmin异常与一些心血管疾病有关（如心肌缺血、限制型心肌病及肥厚型心肌病等）^[3，4，5]。

本实验发现，在正常成人尸检心肌组织中，Desmin呈规则带状分布于心肌细胞中及闰盘。而在克山病人心肌组织中，Desmin荧光染色出现明显异常，心外膜下及远离病灶区的心肌细胞Desmin染色基本正常，而病灶周围的一些心肌细胞中出现异常染色，离病灶越近，Desmin的改变越明显，并与病变程度成正相关。部分心肌细胞的Desmin荧光染色变浅甚至消失，多见于亚急型克山病人心肌组织中，在病灶周围呈弥漫性改变。推测这可能是心肌损伤后的一种部分可逆的变性改变，也可能是由于某种物质缺乏（如微量元素等）导致结构蛋白合成障碍，进而引起克山病的发生。有的细胞内Desmin染色增强，结构紊乱，或呈团状聚集于细胞中间，或呈块状附于细胞膜下，这种改变在慢型克山病时多见。在限制型心肌病病人心肌细胞中可见类似的改变，认为是由于遗传基因的改变引起心肌结构蛋白质Desmin异常蓄积，破坏心肌纤维的正常结构，影响其收缩及舒张，而参与疾病的发生与发展^[5]。但在克山病时的这种改变考虑与遗传因素关系不大，可能是心肌损伤的一种不